Способ определения тромбина, плазмина, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических жидкостях

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБИНА, ПЛАЗМИНА, ТРИПСИНА И ТРОМБИНОПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем взаимодействия пробы биологической жидкости с субстратом с последующим определением продуктов гид ролиза фотометрически, спектрометрически или флюоресцентноспектрофотометрически , отличающийся тем, тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве субстрата используют вещество общей формулы R гли-про-X-NH-R или овщей-формулы R -гли-про-арг-NH-R , где R - водород или блокирующая ацильная или сульфанильная группа; R - замещенный ароматический а углеводородный остаток; (О X - аргинильнан или лизильная со группа.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕ(НИХ

РЕСПУБЛИН

3(51) G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2440347/28-13 (62) 2373901/23-04 (22) 21.01.77 (23) 21.06.76 (31) 8224/75 (32) 23.06.75 (33) Швейцария (46) 23.06.84. Бюл. Р 23 (72) Ларс Гундро Свендсен (Норвегия) (71) Пентафарм АГ (Швейцария) (53) 612. 13 (088. 8) (56) 1. Збарский Б.И., Иванов И.И., Маддашев С.P. Биологическая химия.

М., Медгиз, 1960, с. 123-124. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБИНА, ПЛАЗМИНА, TPHIICHHA И ТРОМБИНОПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем взаимодействия пробы биоло„.,SU„„> A гической жидкости с субстратом с последующим определением продуктов гид ролиэа фотометрически, спектрометрически или флюоресцентноспектрофотомет. рически, отличающийся тем, тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве субстрата используют вещество общей формулы

R = гли-про-Х-NH-R ! или овщей .формулы

R -гли-про-арг-NH-R

Ф где R — водород или блокирующая ацильная или сульфанильная группа;

R — замещенный ароматический

2 углеводородный остаток;

Х вЂ” аргинильная или лизильная группа.

1099839 или общей формулы

R -гли-про-apr-NH-R (2)

1 где R — водород .или блокирующая ацильная или сульфанильная группа;

R — замещенный ароматический углеводородный остатоку

Х вЂ” аргинильная или лиэильная группа.

Субстрат может быть протонизован минеральной кислотой, например НСХ,, HBr, H SO или Н РО,или органической кислотой, например муравьиной, щавелевой или винной. 40

R — ацильная группа может быть изображена частичной формулой R †СО-,, где R - алифатический углеводородный остаток с 1-17 предпочтительно 1-8, атомами С; аралифатический углеводородный остаток, алифатическая группа которого содержит 1-6 атомов С; циклоалифатический углеводородный остаток; ароматический углеводородный остаток; алкилоксигруппа с 1-17, предпочтительно 1-6, атомами С, или 50 бензилоксигруппа. R может обозначать нераэветвленную или разветвленную алкильную группу, например метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил и т.д. до гептадецила; бензильную 2-фенилэтильную, 3-фенилпропильную и т.д. до 11-фенилундецильной группы; циклогексильную или фенильную, ж - нафтильную, Р -нафтильную или бифенильную группу, а также бенэилоксигруппу. 60

R — сульфонильная группа — может представлять собой алкансульфонилгруппу, алкановый остаток которой содержит 1-17, предпочтительно 1-6„ атомов С, например метан- или этан30

Изобретение относится к медицине, а именно биологическим методам исследования биологических жидкостей.

Известен способ определения тромбина, плазмпна, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических 5 жидкостях путем взаимодействия пробы биологической жидкости с субстратом с последующим определением продуктов гидролиза фотометрически, спектрометрически или флюорографически (1).

Однако известный способ недоста-. точно чувствителен.

Бель изобретения вЂ,повышение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем,15 что согласно способу определения тромбина, плазмина, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических жидкостях путем взаимодействия пробы биологической жидкости с субстратом с последующим определением про-20 дуктов гидролиза фотометрически, спек трометрически или флюоресцентноспектрофотометрически в качестве субстрата используют вещество общей Формулы.

1 2

R -гли-про-Х-NH-R (1) сульфонильную группу или арсульфонильную группу, ароматическое ядро которой может быть замещено одной или несколькими (например, тремя) алкильными группами, например бензолсульфонильную, и-толуолсульфонильную или нафталинсульфонильную группу.

R может представлять собой, например, п-нитрофенильную, 2-нафтильную или 4-метокси-2-нафтильную группу.

Субстрат можно получать различны-. ми известными методами, например, согласно одному из них связывают хромофорные группы (R в формуле 1) с С-концевой аминокислотной группой.

Эти группы одновременно имеют функцию С-концевых групп, защищающих карбоксильную группу во время ступенчатого соединения аминокислот при образовании желаемой пептидной цепи. Остальные защитные группы селективно отщепляют от целевого продукта беэ влияния на хромофорную группу.

Анализ элюатов и продуктов проводят путем тонкослойной хроматограФии.

Для этой цели применяют покрытые гелем двуокиси кремния Ф 254 стеклянные пластинки. Для проявления тонкослойных хроматограмм применяют следующие системы растворителей: хлороформ:метанол 9:1; н-пропанол:этиловый эфир уксусной кислоты, вода 7:1:2; н-бутанол:уксусная кислота; вода

3:1:1.

Хроматограммы проявляют сначала в ультрафиолетовом свете и потом путем реакции с хлором/толуидином.

Подгруппа определенных формулой I субстратов соответствует веществу, описанному следующей формулой

R -гли-про-apr-R (1 где R — алкилоксикарбонильная группа, алкилостаток которой содержит 1-6 атомов С, аралкилоксикарбонилгруппа, алкиленовый остаток которой содержит 1-6 атомов С, алкансульфонильная группа, алканостаток которой содержит

1-6 атомов С, арилсульфонилгруппа, арилостаток которой содержит в соответствующем случае заместители, или алкансильная группа, алканостаток которой содержит 1-6 атомов С;

R — h-нитрофенильная, 2-нафтильная или 4-метокси-2-нафтильная группа.

Субстраты этой формулы имеют высокую восприимчивость не только в отношении плаэмина и трипсина, а также и в отношении тромбина и тромбиноподобных энзимов.

Н р и м е р 1. N"-Кбо-гли-про-apr-пНА НСХ; кбо-арг-рНА НСХ.

1099839

В круглодонной трехгорлой колбе емкостью 250 мл Растворяют 16,0 г высушенного пятиокисью фосфора кбоарг-ОН НСЮ в 90 мл абсолютного ГМПТА (триамид N N, N, N, N " — гексаметилфосфорной кислоты) без доступа влаги при 20 С. К полученному раствору прибавляют при комнатной температуре сначала раствор 4,74 г триэтиламина н 10 мл ГМПТА и затем

16,4 г и-нитрофекилизоцианата (100%-ный избыток) по порциям.

После 24 ч при 20 С ГМПТА большей частью отгоняют в вакууме. Остаток экстрагируют неоднократно 30%-ной уксусной кислотой.. Остаток выбрасывают.

Соединенные экстракты уксусной кислоты для дальнейшей очистки наносят на.уравновешенную 30%-ной уксусной кислотой колонку Сефадекс Г-15 и элюируют ЗОВ-ной уксусной кислотой. Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином при ос вобождении п-нитроанилина, подвергают сушке вымораживанием. Получают

l2,6 r аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограм ме в системе растворителей В.

Элементный; анализ,%: С 51,2Э (51,67); Н 5,48 (5,42); N 17,,92 (18,08); Cf 7,50 (7,73).

С2о Н 5 Иь05СХ

П p e p N -Кбо-глк-про06

-apr-nHA НСХ.

4,65 г соединения примера 1 обрабатывают 40 мл 2 í. HBr в ледяной уксусной кислоте без доступа нлаги при перемешинакик в течение 1 ч при

20 С. Пептидное производное при этом

РаствоРяется прк выделении СО2. Реак-4 ционный раствор при сильном перемеши. нанни прибавляют по каплям к 250 мл абсолютного эфира, причем выпадает (2HBr) Н-apr-nHA. Эфирную фазу отсасывают, после чего промывают твердую фазу еще 4 раза, применяя по 45

100 мл абсолютного эфира, с целью удаления образовавшегося в качестве побочного продукта бензилбромида, а также избыток HBr и уксусной кислоты

Путем сушки в вакууме пластинками 50

NaOH получают деблокированный продукт с количественным выходом. Сухой (2HBr) Н-арг-РНА растворяют в 25 мл диметилформалида. К охлажденному до

-10 С раствору прибавляют 1,40 мл триэтиламина. Образуется осадок, который отфильтровывают и дополнительно промынают небольшим количеством холодного диметилформамида. К фильтрату прибавляют при -10 С 4,70 г о кбо-гли-про-п-нитрофенокси. Через 60 несколько часон температура реакцио онного раствора поднимается до 20 С. о

Раствор опять охлаждают до -10 С и буферуют 0,35 мл триэтиламина. Через

16 ч прибавляют е е Раз 0,35 и три 65 этилами<а при — 10"C. Еще через 24 ч концентрируют реакционный раствор в вакууме досуха. Остаток растворяют н

50 мл метанола. После прибавления

0,8 мл кон:::".трировакной соляной кис. лоты концентрируют раствор досуха н вакууме при. 20 С. Эту операцию повторяют 3 раза с целью перевода гид; робромида трипептида в гидрохлорид.

Сырой гидрохлорид трипептида растворяют в 50 мл метачола и предварительно счищают при помощи фильтрации гелем через колонку Сефадекс

ЛХ-20 .

Для дальнейшей очистки концентрируют н вакууме ту фракцию метанола, которую MQKHQ Расщеплять обработкой трипскном с освобождением n-. lèòðoанилкна. Остаток растворяют в ЗOЪ-ной уксусной кислоте. Раствор очищают путем фильтрации гелем на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефацекс Г-15 . Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-Hèòpoàíèëèна, после прибавления 0,80 мл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Получа ют 3,64 г (58,8% от теоретического) аморфного легкого порошка, который однороден н тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Элементный анализ,Ъ: С 52,09 (52,38); Н 5,83 (5,70); N 18,33 (18,10); С1 5,75 (5,73).

С-,Н 14 О СИ

Анализ дает аминокислоты в правильном соотношении: арг: 0,96-гли:

:1,00-про:0,96.

Г р и м е р 3. Н-Гли-про -арг-nHA 2НС2.

61,91 г полученного по примеру 2 соедкнечия без доступа влаги обрабатывают 300 мл 3 к.соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте с перемешиванием в течение 2 ч при 35 С

Пептидное производное при этом растворяется при выделении СО2.

Реакционный раствор при сильном перемешиваник прибавляют по каплям к

2 л абсолютного эфира, причем выпадает Н-гли-про-арг-пН-2НСХ в виде хлопьев. Эфирную фазу отсасывают, после чего промывают тнердую фазу еще

4 раза, применял по О, 5 л абсолютного эфира, с целью удаления образовавшегося в качестве продукта расщепления бензклхлорида и избытка соляной и уксусной кислот.

Путем сушки в вакууме плитками

ИаОН получают деблокированный продукт с количественным выходом. Для дальнейшей очистки растворяют высушеккый продукт в 900 мл ЗОВ-ной уксусной кислоты. Раствор очищают путем фильтрации гелем на уравновешенной ЗОВ-кой уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 . При этом

3 09 3<339 разделяют злюат уксусной кислоты на 2 фракции, которые обе можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина.

Главная фракция содержит желаемый продукт, а побочная фракция — исходный материал. После прибавления

8 мл концентрированной соляной кислоты к главной фракции ее подвергаю сушке вымораживанием.

Получают 43,5 г аморфного порошка,)O который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей H.

Элементный анализ,Ъ: C 43,38 (43,77); Н 5,88 (5,80); N 21,72 (21,49); CZ 13,41 (13,60) .

С33Н д И8О СХ .

Пример 4. 2,09 г полученного соединения из примера 3 растворяют в

25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют

555 мкл триэтиламина и непосредствен 20 но после этого 1,13 г и-нитрофенилового эфира фенилуксусной кислоты.

Реакционный продукт обрабатывают, как описано выше.

Очистка. Фильтрацию гелем осущест-25 вляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксус ной кислотой колонке Сефадекс Г-15

Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроани-30 лина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвер гают сушке вымораживанием.

Выход 1,99 г (82,5Ъ от теоретическогo) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограм- " ме в системе растворителей В.

Элементный анализ,Ъ: С 54,06 (53,77); Н 5,78 (5,85); N 18,83 (18,58); СХ 5,79 (5,88) .

С у Н N60e С

4О

Пример 5. N"-Фенилпропионил-, -гли-про-арг-пНА.НСХ.

2,09 r полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметил4ормамида. После охлаждения до — 10ОС прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 1,19 г и-нитрофенилового эфира 3-фенилпропионовой кислоты 50 (т.пл. 97-98,5 С). Продукт реакции обрабатывают, как описано выше. Филь трацию гелем осуществляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотной колонке Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсиногл с выделением п-нитроанилина, после при бавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

6О

Выход 2,06 г (83,5Ъ от теоретического) аморфного порошка, который од:нороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей B.

Элементный анализ,Ъ: С 54.2 (54,50); Н 5,98 (6,04); N 18,29 ); (18,16); СХ 5,63 (5,75).

С,„Н„NgOe CX

OC

Пример 6. N -Циклогексилкарбонил-гли-про-арг-nHA HCI.

2,09 r полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до

-10 С прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 1,10 r n-нитрофенилового эфира циклогексикарбонсвой кислоты. Продукт реакции обрабатывают дальше, как описано выше.

Фильтрацию гелем осуществляют на уравновешенном ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию" элюата уксусной кислоты, можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 1,87 г (78,6Ъ о теоретического) аморфнсго порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Элементный анализ,Ъ: С 52,70 (52,47); Н 6,72 (6,61); N 19,03 (18,83); СР 5,83 (5,96).

С Н oNpиьСХ

Пример 7, N --Каприлоил-гли0(, -про-арг-пНА НС1.

2,09 г полую=-нного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл риметилформамида. После охлаждения до †10 прибавляют 555 мкл триэтиламина и непосредственно после этого

1.17 г и-нитрофенилового эфиракаприловой кислоты. Реакционный продукт обрабатывают, как описано выше.

Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять путем обработки трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления

320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 1,99 г (81,4Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограглме в системе растворителей В.

Элементный анализ,Ъ: С 52,84 (53к06)„" Н 7кl5 (7 09) И 18к58

;18,34); Cl 5,73 (5,80).

С,„"<,Н4 И80г, СХ

Пример 8. N -Иоэ-гли-проОС

-арг-пНА НС2.

2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до

-10 С грибавляют 555 мкл триэтиламина и непосредственно после этого

840 i ë хлорангидрида и-толуолсульфоновой кислоты (тоэилхлорида). Про1099839 дукт реакции перерабатывают дальше, как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной

30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 2,17 г (84,9Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растнорителей В.

Элементный анализ,Ъ: С 48,50 (48,86);Н 5,60 (5,52); N 17,73 (17,53); S 5,19 (5,02); CY 5,49 (5, 55) .!

С „Н„ >,О,ВС р и м е Р 9. М -БензолсульК фонил-гли-про-арг-пНА HCI.

2,09 r полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до

-10 С прибавляют 555 мкл триэтилами- 25 на и после этого 780 мг хлорангидрида бензолсульфононой кислоты.

2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до

-10 С прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 345 мкл хлорангидри да метансульфоновой кислоты. Продукт реакции обрабатывают дальше, как описано выше.

Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, 60 которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Продукт реакции перерабатывают дальше, как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой ко-. лонке Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке нымораживанием.

Выход 1,95 г (78Ъ от теоретического) аморфного порошка, который 40 однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Элементный анализ, %: С 47,79 (48,03); Н 5,40 (5,32); N 18,11 (17,93); S 5,06 (5,13); Cf 5,61(5,67)45

С < Н gg N8Oz SC

Пример 10. N -Метансульфонил-гли-про-арr-пНА НСЫ.

Выход 1,70 г (75,5Ъ от теор..тического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме н сис-еме растворителей В.

Элементньй анализ,Ъ: С 42, 88 (42,66)> Н 5>63(5,55); N 20,08 (19,90) > S 5,62 (5,70); СЫ 6,21 (6, 30), С и> Н, N>> O y S C f

Пример 11. Б -2-НафталинМ сульфонил-гли-про-арг-nHA ° НC f.

2, 09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют 555 мкл триэтил0 амина и после этого 1, 0 г хлорангидрида нафталин -2-сульфоновой кислоты

Продукт реакции обрабатывают, как описано выше.

Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной ЗOЪ-ной уксусйой кислотой колонке Càôàäåêñ Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроани лина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход, 1,81 r (66,8Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Элементный анализ,Ъ- С 51,88 (51,59); Н 5,19 (5,23); N 16,75 (16,60); Я 4,62 (4,75); СХ 5,12 (5,25) .

С Н ИзО БСЙ

II р и м е р 12. N -Изобутилоксикарбонил-гли-про-арг-пНА.НС2.

2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до

-10 С прибанляют 555 мкл триэтиламина и после этого 650 мкл изобутило- ного эфира хлормураньиной кислоты.

Реакционный продукт перерабатыгают дальше, как бписано ныае.

Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30%-ной уксусной

:кислотой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 1,71 (73,1Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Элементный анализ,Ъ: С 49,06 (49,27); Н 6,42 (6,37); М 19,33 (l9 15); СК 5, 98 (6, 06) .

Спр Н > Х Оу СХ

Пример 13. N -Кбо-гли-про-apr-2-HA HCI; N -кбо-арг (NOg ) -2-HA.

1099839

3,53 г хорошо высушенного кбо-арг (N0 )-OH без доступа влаги растворяют в 150 мл тетрагидрофурана/диметилформамида (3:1). После охлаждения до -10 С к раствору прибавляют

1,39 мл триэтиламина и потом по капг лям в течение 15 мин раствор 1,35 г изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты в 20 мл тетрагидрофурана, причем температуру выдерживают от

-10 до -5 С. К полученному раствору и 0 затем прибавляют по каплям раствор

1,72 r п-нафтиламина в 15 мл тетрагидрофурана, причем поддерживают указанную температуру. Реакционную смесь составляют стоять н течение 15

24 ч при комнатной температуре. После отгонки растворителя в вакууме промывают остаток подряд три раза дистиллированной водой, три раза

5%-ным раствором гидрогенкарбоната

20 натрия и опять три раза дистиллированной водой. После сушки н вакууме растворяют сырой продукт в метаноле и хроматографируют через ураннонешенную метанолом колонку Сефадекс

ЛХ-20 ° Из одной фракции элюата получают 3,75 г кристаллического

OC соединения Н -кбо-арг-(ИО ) -2-НА (78,4Ъ от теоретического) с т.пл.

173-174,5 С, которое однородно н

О тонкослойной хроматограмме в систе-. мах растворителей А и Б.

Элементный анализ,Ъ: С 60,82 (60,24); Н 5,63/ (5,48); N 17,48 ,(16,72).

3 )

С„Н „. 1 О, Пример 14. Н-арг-2-НА HCI.

957 мг соединения N -кбо-арг(NOg) †2-, -НА навешивают в реакционном сосуде аппарата Сакакибара. 15 мл высушенного фтористоводородного газа конден-40 сируют в реакционном сосуде. После реакции через 1 ч при 0 С при перемешивании отщепляют нитрозащитную группу аргинина, а также карбобензоксигруппу. Конденсированный фтористоно- 4 . дородный газ отгоняют в вакууме из реакционной смеси и остаток растворяют в диметилформамиде. для перевода производного аминокислоты н солянокислую соль прибавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и раствор концентрируют досуха. После днукратного повторения . этого процесса растворяют остаток в 50 мл 40%-ной уксусной кислоты. Дляочистки наносят раствор уксусной кислоты на уравновешенную 30%-ной уксусной кислотой колонку Сефадекс Г-15 и элюируют 30%-ной уксусной кислотой. Фракцию элюата, которую можно 60 расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 4 73 мг (63,5% от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограм. ме н системе растворителей B.

Элементный анализ, %:

С 51, 82 (51, 62); Н 6, 18 (6, 23);

N 17, 08 (18, 81); Cl 18, 75 (19, 05) .

С,g Hgg NgOC @

Пример 15. N -Кбо-гли-проapr-2-HA HC1..

372 мг соединения по примеру 14 подвергают взаимодействию с 470 мг кбо-гли-гро-ОпНП, получая соединения

N -кбо-гли-арг-2-НА НС1 Фильтронани

1» гелем осуществляют на уравновешенной уксусной кислотой колонке Сефадекс

Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением инафтиламина, после прибавления

80 мкл концентрированной со 1яной кислоты подвергают сушке ныморажинанием.

Выход 425 мг (68,1% от теоретического) аморфного порошка, который однброден н тонкослойной хроматограмме в системе растворителей B.

Элементный анализ,Ъ: С 60,11 (59,65); Н 6,25 (6,14), N 16,07 (15,! 1); .CZ 5, 59 (5, 68) .

С )< Ньз NyOqC1П р и м е p lo. N -Гли-про-арг,— 2-HA HCI.

625 мг соединения N -кбо-гли-про1

-арг-2-НА.НСХ деблокируют, как описано выше, и растворяют в 8 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 14 0 мкл триэтило амина и после этого 210 мг хлорангидрида и-толуолсульфононой кислоты(т.пл.

67-69"С) . Реакционный продукт обрабатывают известными приемами.

Фильтрование гелем осуществляют на уравнонешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением Р -нафтиламина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 500 мг аморфного порошка.

Элементный анализ,Ъ: С 56,13 (55,93); Н 5,86 (5,95); N 15,48 (15,?2); S 5,07 (4,98); CZ 5,39 (5, 50) .

Пример 17. N -Кбо-гли-про-арг-4-NeO-2-НА. НСУ1 N -кбо-арг

К (Ю ) -4-Мео-2-hA.

3, 53 г кбо-apr(NO< ) -ОН согласно примеру 13 подвергают взаимодеистнию с 2,17 г 4-метокси-2-нафтиламина и перерабатывают, как описано в этом примере. Фильтрование гелем осущестнляют на уранновешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ 20 .

Из одной фракции элюата получают

3,35 г (65,9% ст теоретического) 1099839

35 кристаллического соединения N êáoapr(NO<) 4-Ме0-2-НА, которое однородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителей А и Б.

Элементный анализ,Ъ: С 59,18 (59,05); H 5,43 (5,55); N 16,49 (16,23) .

С„Н„N&O6

Пример 18. Н-Apr-4-Мео-2-НА 2НС2.

1, 02 г соединения N -кбо-apr (NOq) -10

К

-4-МеО-2-НА подвергают взаимодействию получая соединение Н-apr-4-МеО-2-НА 2НС2.

Фильтрование гелем осуществляют на уравновешеннсй 30%-ной уксусной 15 кисло ой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 4-метокси-2-нафтиламина, после прибавления

320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вы ораживанием.

Выход 570 мг (71,0Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хромато грамме в системе растворителей В.

Элементный анализ,Ъ: С 51,08 (50 88); Н 5 98 (б 03); N 17 75 (17,45); CI 17,55 (17,67).

С <, Н„),О,СЫ

Пример 19. 402 мг соединения H-арг-4-МеО-2-HA НСХ подвергают взаимодействию с 470 мг кбо-гли-про-ОпНП, получая соединение N -кбо ( — гли-про-арг-4-МеО-2-HA. HCХ.

Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой 40 трипсином с освобождением 4-метокси2-нафтиламина, после прибавления

80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 493 мг (75,4Ъ от теоретичес-45 кого) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Элементный анализ,Ъ: С 59,01 (58,75); Н 6,10 (6,16); N 15,19 ..50 (l4,99); Cl 5,35 (5,42).

Пример 20. 655 мг соединения Ф-кбо-гли-про-арг-4-МеО-2-HA 55

HCI деблокируют и растворяют в 80 мл диметилформалина. После охлаждения до -10ОС прибавляют 140 мкл триэтилалина и после этого 210 мг хлорангидрида и-толуолсульфоновой кислоты.

Продукт реакции перерабатывают даль- 60 ше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 4-метокси-2-нафтиламина, после прибавления

80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживаниPM.

Выход 465 мг (69,4% от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Элементный анализ,%: С 55,7 5 (55,72); Н 6,01 (5,98); N 14,98 (14,54); S 4,59 (4,76); CI 5,16 (5,26} .

Cq) Нло N7О SCX

Пример 21. N -Моз-гли-пролиз-пНА НСР;

N-БОК-N -кбо-лиз-пНА. т

19, 0 г соединения N ÁOÊ-N -кбо-лиэ-ОН растворяют в 100 мл ГМПТА и прибавляют 5,06 г триэтиламина и потом 16,4 г п-нитрофенилизоцианата.

По истечении 24 ч реакционный раствор с перемешиванием прибавляют

1 по каплям к 1 л 2Ъ-ного раствора гидрогенкарбоната натрия. Осажден-. ный продукт отфильтровывают и промывают трижды по 0,5 2%-ного раствора гидрогенкарбоната натрия, трижды по 0,5 л дистиллированной воды, трижды по 0,5 0,5 н. соляной кислоты и трижды по 0,5 л дистиллированной воды. Полученный продукт высуши-. о вают в вакууме при 40 С и после этого зкстрагируют дважды, применяя по 30 мл нагретого до 70 С диметилформамида, причем желаемый продукт полностью растворяется, в то время как побочный продукт, NN -бис-и-яитI рофенилмочевина, остается в нерастворенном виде. Раствор диметилформамида конц нтрируют в вакууме пРи 40 С.

Остаток растворяют в метаноле и путем фильтрования гелем через урав\ I новешенную метанолом колонку Сефадекс ЛХ-20 получают 18,85 (75,3% от теоретического) кристаллического соединения N"-EOK-Ф-кбо-лиз-пНА с т.пл. 125-.125,5 С, которое однородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителей А и В .

Элементный анализ,Ъ: С 60,49 (59, 99); Н 6, 35 (6, 44); N 11, 48 (11, 19) .

С „- Н 1 N

Пример 22. N -Моз-гли- про-лиз E — кбо) -пНА.

1, 5 г соединения N -БОК-N -кбо-лиз-пНА обрабатывают, перемешивая

1 ч при 20 С, 20 мл трифторуксусной кислоты без доступа влаги, причем производное аминокислоты растворяется с выделением СО . Реакционный раствор при сильном перемешивании медленно прибавляют по каплям к

150 мл высушенного эфира, причем выпадает Н-лиз (C-кбо)-пНА-трифторацетат, Эфирную фазу отсасывают фильтровальной палкой. Оставшийся

1099839 осадок промывают еще 4 раза, применяя по 50 мл сухого эфира для удаления избыточной трифторуксусной кислоты. Сушкой в вакууме плитками едкого натра получают деблокиронанный продукт с количественным выходом. Сухой трифторацетат производного аминокислоты растворяют н 15 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 C прибавляют к раствору

415 мкл триэтиламина для освобожде- 1О ния произнодного аминокислоты из трифторацетата. К реакционной смеси прибавляют 1,48 г моз-гли-про-ОпНП.

Продукт реакции перерабатывают дальше, как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной метанолом колонке Сефадекс

ЛХ-20 .

Выход 1,77 г (83.2-о от теоретичесcoro) аморфного вещества, которое однородно в тонкослойной хроматограмме и системах растворителей А и

Б. и, Пример 23. N -Моз-гли-npo-JIN3-пНА HCI. 25

1,42 г соединения N -моз-гли--про-лиз(Е-кбо) -пНА деблокируют.

Фильтрование гелем осущестнляют на

;;:ðàâíîâåøåííîé 30Ъ-ной уксусной кио.лстой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, .оторую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-, HHTpo анилина, после прибавления 160 мкл концентр:рованной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 1040 мг (85,1Ъ от теорети-ческого) аморфного порошка, которь1й однороден н тонкослойной хроматограъме н системе растворителей В.

Пример 24. М -Изобутокси- 40 карбонил-гли-про-лиз — nНА НСХ„ N

БОК-гли-про-лиз-(Е-кбо)-nI!A.

20 г соединения N -БОК-N -кбоcL Е

-лиз.-(c..-кбо)-пНА деблокируют и раст-воряют н 20 мл диметилформамида.

После охлаждения до — 10 C к раствору прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 1,73 г ВОК-гли-про-О. НП, Реакционный продукт перерабатывают, как описано выше. Фильтрование гелем осущестнляют на уравновешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ-20 .

Выход 2,20 г 84,0Ъ от теоретического)аморфного вещества, которое однородно н тонкослойной хроматограмме н системах растворителей А и Б.

Пример 25.)(-Изобутоксикарбонил-гли-про-лиз (E.-кбо) -л HA

1,31 г соединения Ч".-БОК-гли-про-лиз(Я-кбо) -пНА деблокируют и раство-6() ряют н 12 мл диметилформамида. После охлаждения до -10вC к раствору при-бавляют 280 мкл триэтиламина и после этого 285 мкл изобутилоного эфира хлормуравьиной кислоты. Продукт 65 реакции обрабатывают, как описано ныше., Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ-20 .

Выход 1,15 r (87,8Ъ от теоретического)аморфного вещества, которое однородно и тонкослойной хроматограмме н системах растворителей А и Б.

Пример 26. " -Изобутоксикарй, бонил-гли-про-лиз-иНА. HC J.

660 мг соединения N -изобутоксикарбонил-гли-про-лиз (Е-кбо) -к HA деблокируют. Фильтронание гелем осущестнляют на ураннонешенной 30Ъ-ной уксусной кислоты колонке Сефадекс

Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением r нитроанилина, после прибавления

80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 430 мг (77,2o- от теоретического)аморфного порошка, который однороден и тонкослойной хроматограмМе в системе растворителей В.

Пример 27. Ф -Моз-гли-про-лиз-2-HA ° НСХ; И" -БОК-М кбо-rIva-2-HA

1,90 г соединения N -БОК-N †кбо-лиз-OH поднер,ают взаимодействию, как указано при получении Ы -кбо-арг-(NOq)-2-НА., получая соединения

N -БОК-N -кбо-лиз-2-HA.

Фильтрование гелем осуществляют на уравнонешенной метанолом колонке " Сефадекс ЛХ-20 .

Выход 1,60 r,63,3Ъ от теоретического) аморфного соединения, которое однородно н тонкослойной хроматограмме н системах растворителей и Б.

Пример 28. I< -Моз-гли-про-лиз(Е-кбо) -2-НА, 1,0з г соединения " -БОК- -кбоГ

Ф

-лиз — 2-НА деблокируют, как указано при получении Й -моз-гли-пролиз-(Е -кбо)-пНА„ и растворяют в

20 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С к раствору прибавляют 280 мкл триэтиламина и непосредственно после этого 985 мг моз-гли-про-ОпНП. Продукт реакции перерабатывают дальше,, как указано выше.

Фильтрование гелем осущестнляют на уравновешенной метанолом колонке

" Сефадекс ЛХ-20 . Выход 1, r аморфного вещества, которое однород-

Но в тонкослойной хроматограмме.

Пример 29. И -моз-гли-про 6

-лиз-"-HA.HCZ.

715 мг соединения N -моз-гли †проК

-лиз (E-кбо) -2-НА деблокируют, как указано выше.

Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30Ъ-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .

Фракцию элюата уксусной кислоты, ко-.îðóM можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 2-нафтил!

099839 амина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 470 мг (76,3Ъ от теоретичес кого)аморфного порошка, который одно-. роден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Пример 30. N -Моз-гли-про-лив,-4-Ме0-2НА НСР; « -БОК- NE-кбоК

-лиз-4- le0-2-HA.

1,90 r соединения > -БОК- -кбо<< Е

-лиз-ОН подвергают взаимодействию с

1,22 r 4-метокси-2-нафтиламина согласно примеру 13.

Фильтрование гелем осуществляют на уравнове", енной метанолом колонке 15 Сефадекс ЛХ-20 .

Выход 1,82 r (168,0Ъ от теоретического) аморфного соединения, которое однородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителей.

Пример 31.}(« -Моз-гли †про-лиз (E-кбо) -4-Ме0-2-НА.

1,07 г соединения }(-БОК- N -кбо-, -лиз-4-МеО-2-НА деблокируют согласно примеру 18 и рас гворяют в 20 мл диметилформамида. После охлаждения до — 10 С к раствору прибавляют 280 мкл триэтиламина и после этого 985 мг моз-гли-про-ОоНБ. Реакционный продукт перерабатывают согласно примеру 1.

Фильтрование гелем осуществляют 30 на уравногешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ-20 .

Выход 895 мг (60,2Ъ от теоретического) аморфного вещества, которое однородно в тонкослойной хроматограм-35 ме в системах растворителей.

Пример 32. N -Моз-гли-просс.

-лиз-4-МеО-2-HA HC E.

745 мг соединения по гримеру 31 деблокируют, как указано выше. Филь- 4О трование гелем осуществляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 4-метокси-2-нафтил- 45 амина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.

Выход 470 мг (72,7Ъ от теоретичес. кого) аморфного порошка, который од- 59 нороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.

Субстраты формулы 1 пригодны для определения энзимов, расщепляющих пептидные цепи на карбоксильной сто- 55 роне как аргинина, так и лизина.

К этой группе энзимов относятся тромбчн и тромбиноподобные энзимы, экаритромбин, плазмин и трипсин. При помощи субстратов можно также опреде- Я} лять проэнзимы, например протромбин, плазминоген и трипсиноген, активаторы и ингибиторы энзимов, например антитромбины, в частности софактор гепарина (антитромбин III) и гепарин далес антиплазмин <л.; -макроглобулин), ингибиторы трипсина (.,-антитрипсин), апротинин, ингибиторы трипсина соевых бобов и ингибиторы плазмина.

При полн,.л активиров< нии проэнзи-< мон активаторами или с лесями активаторов образуется эквивалентное количе:.тво энзима, которое можно измерять.

Измерение концентрации активаторов проводят таким образом, что определяют скорость образования энзима из проэнзима. Эта скорость пропорциональна концентрации активатора.

Пример 33. Субстрат, например < -кбо-гли-про-арг- HA НСР, при"

5 меняют для определения различных энзимов в плазме крови.

Определение основывается на.том принципе, что образованный ферментативным гидролизом субстрата продукт расщепления ИН вЂ - P имеет УФ-спектр, который отличается от УФ -спектра, субстрата и смещен в направлении больших длин волн. Так, субстрат <4 --кбо-гли-про-арг-РНА НСР имеет максимум поглощения при 302 нм и молярный коэффициент экстинкции 12920. Поглощение субстрата при 405 нм практически равно О.

Образованный при ферментативном гидролизе субстрата продукт расщепления NH,, R,, т.e. n-нитроанилин, имеет максимум йоглощения 380 нм и молярный ко: ффициент экстинкции 13200. При

405 нм коэффициент экстинкции мало понижается, т.е. до 9650. Путем спектрофотометрического измерения при 405 нм можно легко определять степень ферментативного гидролиза субс=рата, которая пропорциональна количеству о=щепленного и-нитроанилина.

Имеющийся в избытке субстрат не мешает измерению при 405 нм. Спектрофотометрическое измерение во всех слу ta"х проводят при 405 нм.

Повышенная водорастворимость соединения обеспечивает определение энзимов в более широких пределах концентрации. Это важно при стандартных способах исследования, так как в этих случаях можно точно определять крайние величины, без предварительного разбавления или концентрирования биологических проб.

Измерения проводят следующим образом.

О, 25 мл раствора энзима (0,56 NI Н/мл тромбина человека, О, 28 NJ Н/м экарин-тромбина человека

1,05 NJ Н/мл стафило-тромбина чело-- века, 4,0 NJ Н/мл батроксобина, 0,4

CtJ/Më плазмина человека и 1,8 NF/ìë трипсина крупного рогатого скота) прибавляют к 2,0 мл буфера трисимидазола (РН-8„4, ионна".. сила

-0,15) . Смесь инкубируют в течение ,2 мин при 37 С. Потом к смеси при18

1099839

17 бавляют 0,25 мл водного раствора субстрата (1 ммоль/мл субстрата по примеру 33 или известного субстрата Й бз-фе-вал-арг-рНА HCX) при 37 C.

Повышение поглощения измеряют спектрофотометрически при 405 нм и за ним непрерывно следят при помощи самопис ца. Количество образовавшегося продукта расщепления представляют собой меру чувствительности субстратов к энзимам. )О

При вычислении образующегося эа

1 мин и-нитроанилина применяют молярный коэффициент экстинкции 10 000 вместо 9á20, так как отношение между расщепляемостью различных субстратов 15 энзимами этим не изменяется. Для вычисления образовавшегося за 1 мин количества (3 -нафтиламина или 4-метокси- -нафтиламина пробу облучают во флуоресцентном фотометре светом длины волн 350 нм. Количество обраэованшегося продукта расщепления определяют измерением интенсивности испущенного при 420 нм. света.

B табл.1 представлена активность тромбина человека, плазмина человека и трипсина крупного рогатого скота„ измер иная при помощи субстратов согласно изобретению при постоянной конце.нтрации субстрата и энзимов; для

-. ." àHíeHèÿ даны соответствующие эначе-30 ния, определенные при помощи -бзМ 0(, -фе- вал-арг-pHA ° HC Р.

Иэ табл.1 видно, что субстраты показынают улучшенную по отношению к плазмину человека, а в большинстве случаен значительно улучшенную Вос приимчивость, чем известный (-бэ-фе"-вал-арг-pHA HCL.. Перечисленные суб-страты имеют значительно лучшую восприимчивость к трипсину крупного рогатого скота, чем известный сравни. тельный субстрат.

Пример 34. В табл. 2 представлена активность экарин-тромбина человека, тромбинкоагулязы человека и батроксобина (из яда Bothraps 45

moojeni), измеоенная посредством субстрата 1 при постоянной концентрации субстрата и энэима; Контролем служат соответствующие измеренные

И -бэ-фе-вал-арг-пНА НС1-значения. 5О

Пример 35. Субстраты можно, например, применять также для определения протромбина и антитромбина.

Е(ля определения протромбина к 0,5 мл глицинового буфера с рН 8,4 и ионной 55 силой 0,3 прибавляют 5 мкл цитратной плазмы. Смесь инкубируют в течение

30 с при 37 C. Затем к инкубиронанной смеси прибавляют 100 мкл нодного раствора тромбопластина кальция (тромбопластин кальция представляет собой активатор протромбина). Полученную смесь инкубируют при 37 С.

После инкубации в течение 2,5 мин активация протромбина скончена. После инкубации более чем 5 мин исчезает часть активированного тромбина вследствие воздействия содержащихся н плазме антитромбинов.После инкубации через 4 мин к указанной смеси прибавляют 1 мл глициноного буфера с рН 8,4, ионной силой 0,3 и температурой 37вС и затем 0,25 мл

1,5"10 "-молярного водного раствора субстрата 1. За ходом гидролиза субстрата следят фотометрическим измерением количестьа освобожденногG за 1 мин и-нитроанилина при 405 нм.

Повышение оптической плотности составляет 0,182 эа 1 мин. Из этого значения и молярного коэффициента экс" тинкции п-нитрофениланилина при

405 нм 10000 вычисляют значение

5,99 mU образовавшегося из протромбина тромбина на 1 мкл плазмы. Из этого нытекает, что 5,99 ед. субстрата

1 тромбина было образовано из протромбина на 1 мл плазмы, что соответствует 1б2,3 Я1Н-единицы тромбина на 1 мл плазмы. Для определения антитромбина к l мл содержащего 3 USP-единицы гепарина глицинового буфера с рН 8,4 и ионной; силой 0,3 прибавляют 0,1 мл нодногс раствора тромбина концентрацией 25-40 N1H-единиц на 1 мл при 37 С. К полученной смеси прибавляют 2,5-10 мкл цитратовой плазмы, после чего инкубируют смесь в течение 30 <= при 37 C. К инкубированной смеси сразу прибавляют

0„.25 мл раствора полибрена (концентрация 1 мг полибрена на 1 мл 0,3-молярного раствора поваренной соли, полибрен представляет собой состоящий из 1,5-диметил-1,5-диаэаундекаметиленполиметобромида продукт. Полученную смесь инкубируют в течение

30 с при 37 С. Затем к смеси прибав-. ляют 0,5 мл 0,75 10 -молярного водно3 го раствора субстрата 1. За ходом гидролиэа субстрата ненейтралиэонанным антитромбином тромбином следят фотометрическим измерением количестна освобожденного за 1 мин и-нитроанилина при 405 нм. При этом оказывается, что торможение применяемого тромбина различными количествами цитратовой плазмы пропорционально этим копичествам.

Предлагаемый способ по сравнению с изнестным янляется высокочунстнительным и позвопяет определять небольшие количества энзимов, ч=о очень важно в клинической практике.

1099839

Таблица l

Количество освобожденного за 1 мин 1 NJH-единицей тромбина человека или 1 С . -единицей плазмина человека или 1 НР-трипсина крупного рогатого скота ферментативным путем из субстратов продукта расщепления NH<-В,, нмоль

Субстрат (концентрация 1 0 4-M.Тромбин человека

Плаэмин человека

Трипсин крупного рогатого скота

N -Бз-фе-вал-арг-с4.

-rlHA Hcf

28,6

36,0

8,4

45,7

11,2

204,0

20,2

34,7

12,3

18,0

49,5

21,9.

21,3

2,4

60,8

33,8

24,8

28,5

l4,6

47,3

20,1

26,1

27,5

73,8

65,8

195,5

111,0

33,0

16,2

126,0

86,9

43,8

196,0

93,5

28,4

25,3

28,5

19,5

29,6

19,5

95,6

25,9

0,9

125,0

192,6

28,6

22,6

26,1

0,85

19,8

90,5

0,6

19,2

Та блица 2

Количество ферментативно отщепляемого из субстрата за 1 мин соответствующим 1 N1H-, . единице количеством зкарин-тромбина человека, тромбинкоагуляэы человека и батроксобина п-нитроанилина, нмоль

Субстрат (концентрация

l0 4 -M) l Тромбинкоагу- Батрокляза человека собин

Экарин-тромбин человека

N -Бз-фе-вал-арг-nHA HCf

30,7

3,26

102

575

15,81

246,4

ВНИИПИ Заказ 4411/45 Тираж 823 Подписное филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул.Проектная, 4

116,9

109,0

150,8

126,5

21,7

18,2