Способ определения холинотропных свойств веществ

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИНОТРОПНЫХ СВОЙСТВ ВЕЩЕСТВ, включающий специфичное взаимодействие метки с хояинорецептивными зонами сарколеммы нервных волокон, отличающий с я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве метки используют вещество, содержащее 5%-ную взвесь бараньих эритроцитов и 0,2%-ный раствор ацетилхопина при их соотношении 1:1, и по взаимодействию эритроцитов с зонами сарколеммы определяют нгшичие у веществ холин ,отропных свойств.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК . (19) П1) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Г О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3242506/28-13 (22 ) 03. 02. 81 (46 ) 07. 07. 84. Бюл. 9 25 (72 ) А.А. Быкова, В. В. Савкии и Г.А.Попыванова (71) Пермский государственный медицинский институт (53) 616-091. 8(088. 8) (56) 1. Колла В.Э., Обвинцева Л.И.

Изучение биологического .действия новых продуктов органического синтеза. Пермь, "Медицина", 1973, 1,27-33.

2 ° Alain Bienvenue, Annie Rousselet, Gabor Kato P.De+aux Р1иМ1у of .the 1ер16в next to the acetylcholine

receptor protein of torpedo membrane

fragment;

3{51) С 01 N 1 28 A 62 В 10 ОО (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИНОТpOGHbK CBOACTB ВЕЩЕСТВ, вкч ющй специфичное взаимодействие метки с холинорецептивными зонами сарколеммы нервных волокон, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве метки используют вещество, содержащее

5%-ную взвесь бараньих эритроцитов и

0,2%-ный раствор ацетнлхолина при их соотнсшении 1з1, и по взаимодействию зритроцитов с зонами сарколеммы определяют наличие у веществ холинотропных свойств.

1101768

Изобретение относится к медицине, а именно к физиологическим исследованиям.

Известен способ определения холинотропных свойств веществ, включающий взаимодействие радиоактивной 5 метки с нервным волокном f1) .

Однако данный способ не позволяет точно определить взаимосвязь метки с холинорецептивными зонами сарколеммы. 10

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ определения холинотропных свойств веществ, включающий взаимодействие спинмеченых производных аце-15 тилхолина с радиоактивным холинорецептором (2) .

Однако известный способ Не позволяет точно определить взаимодействие вещества с холинорецептивными зонами сарколеммы, так как наличие в мембране липид-белковых компонентов часто приводит к возникновению сигналов неспецифически связанной с этим слоем метки. 25

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем что согласно способу определения холинотропных свойств вещества, включающему специфичное взаимодействие метки с холинорецептивными зонами сарколеммы нервных волокон, в качестве метки исполь-1 зуют вещество, содержащее 5%-ную взвесь бараньих эритроцитов и 0,2Ъ-ный раствор ацетилхолина при их соотношении 1:1, и по взаимодействию зритроцитов с зонами сарколемьщ определяют наличие у веществ холинотропных свойств.

Способ осуществляется следующим 40 образ ом.. .Выделяют одиночное нервное волокно иэ полусухожильной мьюацы лягушки.

Функциональное состояние изолированного волокна оценивают через 3-4 ч 45 после вь целения и инкубации его в растворе Рингера. Для обнаружения некроза волокно просматривают при

600-кратном увеличении микроскопа.

Поврежденные волокна выбраковывают. 50

Все отобранные волокна в интактных условиях отвечают на раздражение электрическим током.

Метку-бараньи эритроциты, связанные с ацетилхолином, готовят следую- 55 щим образом. Нативные бараньи эритроциты обрабатывают глютаровым альдегидом, смешивая 0,25%-ный его раствор и 5%-ную взвесь эритроцитов в сооТ нсиаении 1:1. После 15 мин инкубации при 37оС эритроциты трижды отмывают фосфатным буфером при рН=7,2.

Равные объемы 0,2Ъ-ного раствора ацетилхолннхлорида, разведенного на фосфатном буфере с рН=6,4, и 5 Ъ-ную взвесь обработанных бараньих зрит; роцитов смешивают и инкубнруют 20мин при комнатной температуре. После: инкубации эритроциты дважды отмывают центрифугированием в физиологическом растворе с рН=7,2. Подсчет клеток производят в камере Горяева.

При определении холинорецептивных зон используют взвесь эритроцитов, содержащую 5х10 клеток на 1 мл.

Изолированное волокно помещают на

24 ч в 10 мл суспензии эритроцитов и выдерживают при 4 С в течение 18 ч, трижды отмывают физиологическим раствором с рН=7,2. Количество эритроцитов, фиксированных на 5 мм волокна, подсчитывают под микроскопом при

200-400-кратном увеличении.

Для исключения неспецифической, фиксации эритроцитов в контрольной серии опытов используют эритроциты, обработанные только глютаровым альдегидом, но не ацетилхолином.

ДЛя доказательства фиксации обработанных ацетилхолином эритроцитов именно в области холинорецептивных зон мыаечные волокна предварительно, до соединения с эритроцитами, выдерживают в растворе ацетилхолина при комнатной температуре в течение 1 ч.

Для доказательства специфичности связывания метки, а также определения типа холинорецептора в локусе фиксации эритроцита, осуществляют блокаду

Н- или М-холинорецепторов селективными холиноблокаторами — ot -тубокурарином или атропином, вводя их в концентрации 1х10 4 r/êã массы подопытного животного в спинной лимфатический мешок за 30 мин до препаровки и добавляя их в раствор Рингера о время осуществления препаровки.

Денервированное мыаечное волокно фиксирует 440+69 эритроцитов. B контрольной серии с использованием эритроцитов, необработанных:ацетилхолином, фиксация белка была в пределах 8,6+4,0.

Предварительное насыщение холинорецепторов ацетилхолином или блокада еС- тубокурарином нли атроцином резко снижает число фиксированных на сарколемме эритроцитов.

В табл. 1 приведено количество холинорецептивных зон, связанных с бараньими эритроцитами.

1101768

Т абл ица1

Количество локусов связывания эритроцитов

Опыт

Необработанные Обработанные ацетилхолином ацетилхолином

Денервированное волокно

440+6,9 0,001

8,6+4,0

Денервированное,волокно, выдержанное в ацетилхолине

62+9 к 2 0 с001

Таблица 2 °

Количество локусов связывания эритроцитов, обработанных ацетилхолином

Опыт

440+6,9

Интактное волокно

В условиях блокады Н-холинорецепторов аС -тубокурарином

149+19 0,01

В условиях блокады

М-холинорецепторов атропином

266+35

0t 03

Составитель Л.Стебаева

Редактор P.ÖHöèêà Техред М.Гергель Корректор! A. Власенко

Заказ 4760/30 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул. Проектная, 3

Пример 1. Выделяли одиночное нервное мьыечное волокно, которое предварительно обрабатывали C -тубокурарином с целью блокады Н-хслинорецептивных зон. Этот препарат инъек- 20 цировали В спинной лимфатический мешок лягушки за 30 мин до выделения;

Далее нервное волокно помещали в раствор Рингера на 3-4 ч при комнатной температуре. При анализе специ- 25 фичности интактное мыаечное волокно дополнительно выдерживали в 0,02%-ном растворе ацетилхолинхлорида в течение 1 ч при комнатной температуре.

После выделения и проведения контроля мышечное волокно фиксировали на узкой стеклянной полоске, которую помещали в пробирку, содержащую 10 мл

0,5%-ной взвеси меченых ацетилхолином эритроцитов и инкубировали пре- 35 парат в .течение 18 ч при 4 С.

После инкубации волокно трижды отмывали- эабуференным изотоническим раствором с рН=7,2 и подсчитывали количество эритроцитов на поверхно- 4О сти сарколеммы.

Мышечное волкно, обработанное

a(-тубокурарином, фиксировапо 140 эритроцитов (табл. 2).

В табл. 2 приведено количество зон связывания обработанных ацетил- 45 холином эритроцитов на мышечных волокнах на фоне действия М и Н - холиноблокаторов.

Изобретение позволяет выявить более специфичное взаимодействие метки с хслинорецептивными Зонами сарклиеммы, что повыаает точность определения до 96% по сравнению с известным способом. Предварительная обработка зон сарколеммы химическими соединениями дает воэможность .оценить наличие или отсутстзие у этих соедине.ний холинотропных свойств.