Способ получения иммунной сыворотки против инсулина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РШМУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ИНСУЛИНА путем иммунизации морских свинок инсулином с добавлением адьюванта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве адьюванта используют поливинилпирролидон с мол.весом 3000050000 в количестве 0,15-0,30 г. 9

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПЛ.ЛИК

g D А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРИТИЙ (2i) 3387046/28-13 (22) 25.01.82 (46) 30. 06. 84 Бюл. М - 24 (72) Н.В. Сорокина, Е.M. Гаврилова, Н.Н. Попова, В.В. Давыдова, А,М. Егоров, И.В. Березин, Ю.Э. Кирш и Т.M. Карапутадзе (71) МГУ им. М.В. Ломоносова (53) 615.373(088.8) (56) 1. Brugman Т.V., Arguilla Е.R.

Circular Dichro ic and Jmmunologie

studies of struct ure Relationships

of Jnsaul in and Derivatives, - "Bio-.

chemistry", 1973, v. 12, N - 14, р. 727-732.,.SU„„1099954 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЙ

СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ИНСУЛИНА путем иммунизации морских свинок инсулином с добавлением адьюванта, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве адьюванта используют поливинилпирролидон с мол.весом 3000050000 0,15-0,30 г.

1()99954

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения диагностических препаратов, в частности к способу получения гиперимунной сыворотки против инсулина.

Известен способ получения имунной сыврротки против инсулина путем иммунизации морских свинок с добавлением адьюванта (1 ).

Однако использование адьюванта

Фрейнда ведет к массовой гибели морских свинок, что в свою очередь снижает возможность получения достаточного количества антисывороток против

f5 инсулина.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Указанная цель достигается способом получения иммунной сыворотки против инсулина путем иммунизации морских 20 свинок инсулином с добавлением адьюванта, в качестве адьюванта используют поливинилпирролидон с мол,весом

30000-50000 в количестве О, 15-0,30 г.

Пример 1. Для иммунизации ис-25 пользовали 30 морских свинок (самцы, беспородные — трехцветные, масса

400 г) .

В 1-й день вводят по 1 мл раствора инсулина (150 мкг/мл) в 237. поливинил-3р пирролидона (ПВП) внутримышечно в область подколенных лимфоузлов передних и задних лап.

На 8-й день вводят по 1 мл раствора инсулина (150 мкг/мп) в 23% ПВП внутри-

35 мышечно и внутрибрюшинно.

На 15-й день вводят по I мл (150 мгк/мл) в 237 ПВП внутримьпиечно и внутрибрюшинно.

На 45-й день вводят по 1 мл раствора инсулина (150 мкг/мл) в 237 ПВП внутримышечно и внутрибрюшинно.

На 7-й день после последней инъекции проводят частичное кровопускание из сердца (по 5-10 мл). Первую реиммунизацию проводят через 30 дней после взятия крови, вводя 1 мл раствора инсулина (150 мкг/мл) в 237 ПВП внутримьш ечно и внутрибрюшинно. Последую50 щие циклы реиммунизации проводят аналогично. Титры антисывороток определяют непрямым методом иммуноферментного анализа. Титр антисыворотки от данной морской свинки несколько увеличивался от цикла к циклу и состав5S лял: от 10 свинок — 1/10 000, от

15 свинок — 1/20 000, от 4 свинок

1/40 000.

ПВП используют в количестве О, 150,30 г. В примере описано использо.вание для иньекций 1 мл раствора ин— сулина в 23Х ПВП, что соответствует

0,23 г ПВП на иньекцию, т.е. среднему значению количества, указанног0 в интервале возможных значений.

Нижняя граница интервала обусловлена тем, что при использовании такого количества ПВП увеличивается число свинок, дающих антисыворотку с низким титром. Верхняя граница интервала обусловлена растворимостью

ПВП.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но используют раствор инсулина, 1 мл которого содержал

0,15 г ПВП. Все свинки оставались живы. Титр антисыворотки составил: от

20 свинок — 1/10 000,от 2 свинок

1/40 000.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но используют раствор инсулина, содержащий 0,3 r ПВП.

Результаты аналогичны полученным в примере 1.

Поливинилпирролидон выпускается промышленным способом и широко используется в медицине как кровезаменитель и пролонгатор действия различ— ных лекарственных преператов.

Повышение иммуногенных свойств инсулина в присутствии поливинилпирролидона по видимому связано с образованием электростатического комплекса, что, с. одной стороны, увеличивает размер молекулы инсулина, с другой замедляет его вывод из организма. Способ осуществляют по выбранной схеме иммунизации. Частичное кровопускание из сердца (5 мл) осуществляют на

7-й день после последней инъекции.

Первую реиммунизацию проводят через.

30 дней.

Все морские свинки на протяжении

5 циклов иммунизации, которые прово— дились в течение 6 мес, оставались живы, чувствовапи себя хорошо, образования подкожных язв не наблюдалось.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать г ипериммунную сыворотку с высоким титром. Антисыворотка может быть использована в радиоизотопном и иммуноферментном анализе при количественном определении инсулина в биологических жидкостях.

Применение поливинилпирролидона в качестве адьюванта позволяет исполь1099954 зовать животных для получения антисывороток в течение продолжительного времени (6-8 мес, 5-7 циклов реиммунизации).

При использовании для инъекций раствора инсулина, содержащего 0,150 30 t /мл ПВП приводит к получению антисыворотки с высоким титром, при этом по сравнению с использованием адьюванта Фрейнда увеличивается количество антисыворотки за счет того, что животные при иммунизации не гибнут, от 30 морских свинок получено

213 мл сыворотки.

Специфичность антиинсулиновой сыворотки проверяли в реакции преципитации методом двойной диффузии в гель по Оухтерлони и в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием в качестве антигена инсулин, пролактина, глюкагона, выделенных из поджелудочной железы.

Для реакции препитации использовали штамм ¹ 7. В центральную лунку . вносили неразведенную антиинсулиновуюр сыворотку, исследуемый антиген раститровывали вокруг центральной лунки в следующих разведениях: 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, начиная с исходной концентрации антигена 0,3 мгlмл. Реакция выявила четкую линию преципитаАнтиген

+ а нтитело

1/10 1/50 i /100 1/500 1/1000

Инсулин

+ антиинсулиновая сыворотка 1,5 1,5

1,0

1,3

1,5

Инсулин

+ нормальная сыворотка

0,05 О

0,9 0,4

Пролактин

+ антиинсулиновая сыворотка 1,0 0,5

0,1 О

1,0 0,6

0,05 О

Глюкагон

+ антиинсулиновая сыворотка 1,2 0,9

0,2 0,06 0,01

Глюкагон

+ нормальная сыворотка

1,0 0,4

0,08 0,01

Значение оптической плотности раствора при h = 450 нм

Пролактин + нормальная сыворотка ции во всех разведениях антигена только в случае инсулина. Перекрестных реакций антиинсулиновых сывороток с антигенами глюкагоном и пролактином не наблюдали.

Для проверки специфичности антиинсулиновой сыворотки использовали также непрямой метод ИФА, На поверхность полистироловых микроплат сорбировали антигенинсулин, глюкагон или пролактин, затем в лунки микроплат вносили иммунную сыворотку в разведениях 1/10, 1/50, 1/100, 1/1000. Антитела, содержащиеся в имунной сыворотке, взаимодействовали с антигеном, образуя комплекс антиген-антитело, который выявляли с помощью вторых антител, меченных ферментом (кроличьих антител к иммуноглобулинам морской свинки, ковалентно связанных с пероксидазой). В качестве субстрата пероксидазы использовали 5-аминосалициловую кислоту и перекись водорода. В результате ферментативной реакции наблюдали образование окрашенного продукта с максимум поглощения при,гД = 450 нм. Чем больше антител в исследуемом разведении сыворотки, тем больше образовывалось окрашенного продукта и, следовательно, больше значение оптической плотности (см. таблицу).

Разведения сывороток

1 1 1 (1099954

Составитель Г. Крюкова

Техред Ж. Кастелевич Корректор M. Шароши

Редактор Н. Швыдкая

Заказ 45 19/6

Тираж 688 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Как видно из данных таблицы, значения оптической глотности н реакциях пролактина и глюкагона с BHTHHHcóëèновой сывороткой одинаковы со значениями оптической плотности контрольной реакции инсулин + нормальная сыворотка морской свинки, Таким образом, исследуемая антиинсулиноная сыворот.ка не реагирует с глюкагоном и пролактином, тогда как с инсулином реагирует при большом разведении. Титр исследуемых антиинсулиноных сывороток, полученных от различных животных, н реакции с инсулином колебался н пределах 1/10000-1/20000.

Предлагаемый спос.об позволяет получать сыворотку с высоким титром к инсулину, сократить расход морских свинок за счет снижсния их смертности и тем самым повысить ныход антисынороткн,