Способ получения конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа с синтетическими полиэлектролитами

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГАТОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ путем ковалентного связывания гемагглютинина с ащшированкыми карбодиимидом полиэлектролитами , отличающийся тем, что, с целью пролонгирования иммуногенности целевого продукта, в качестве полиэлектролитов используют сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„Я0„„1115754 А

31 11 А 61 К 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3496237/28 — 13 (22) 30.09.82 (46) 30.09.84. Бюл. N 36 (72) P. В. Петров, P. М. Хантов, А. В. Некрасов, T. 3. Берестецкая, А. Ш. Норимов и М. С. Синяков (71) 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова (53) 576.858 (088.8) (S6) 1. Петров P. В. и др. Иммуногенность конъюгата, полученного путем ковалентной сшивки бычьево сывороточного альбумина сополимером 4-винилпиридина и 4-винилацетилпиридинит бромида. ПАН СССР, 1979, т. 249, N 1, с. 249-252.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке

Р 3433461/28 — 13, кл. А 61 К 39/44, 29.04.82.

3. Chapiro А., De Doang Випо„Ецгор..

Po1ejner f., 1978, v. 10, 1103. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГАТОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИПЕ1А

С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ путем ковалентного связывания гемагглютинина с ацплированными карбодиимидом полиэлектролитами,отличаюгцийся тем, что, с целью пролонгирования иммуногcHHocTH целевого продукта, в качестве полиэлектролитов используют сополимеры акриловой кислоты и 1ч-винилпирро: илона.

11!5754

Изобретение относится к синтезу биологически активных соединений, конкретно к способу получения конънпатов гемагглютинина с поли. мерами — полиэлектролитами.

Известен способ получения конъюгатов взаимодействием очень слабого иммуногена— бычьего сывороточного альбумина с кватер-. низованным поли-4-винилпиридином . Иммунизация полученными конъюгатами вызывает иммунный ответ с накоплением специфичес- IO ких антителообраэующих клеток (на альбумин), число которых значительно превышает число клеток, накапливающихся при раздельном введении животных альбумина и кватернизованного поли-4-винилпиридина (1).

Ф

Однако конъюгаты альбумин- поли-4-винилпиридин не могут найти широкого практического применения, так как кватернизованный поли-4-винилпиридин является весьма токсичным полимером (LD — 80 мг/кг) и, кроме 20 того, получение высоких титров против альбумина не является актуальным для современной иммунологии.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положитель-25 ному эффекту является способ получения конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа с синтетическими полиэлектролитами, заключающийся в ковалентном связывании гемагглютинина с ацилированными карбодиимидом полиэлектролитами, причем в качестве полиэлектролитов используют гетерогенные полиамины (2) .

Недостатком способа является низкая продолжительность иммуногенного действия полу35 ченных коныогатов —, не более 12 сут (табл. 1).

Целью изобретения является пролонгирование иммуногенности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что со40 гласно способу получения конъюгатов гемагглю тинина вируса гриппа с синтетическими полиэлектролитами путем ковалетного связывания гемагглютинина с ацилированными карбодицидом полиэлектролитами, в качестве полиэлектролитов используют сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона.

Сущность предлагаемого способа состоит в ковалентном связывании по реакции ацилирования карбодиимидным способом сополимера акриловой кислоты и Й-винилпирролидона с гемагглютинином в буферном растворе (рН 6,8), с ионной силой 0,1 — 1,0 M

1чаС1 при 2 — 4 С. В качестве ацилирующего агента используют водорастворимый п-толуол- 55 сульфат- N- (2- (4- морфолиний) этил) карбодиимид.

Ковалентное связывание гемагглютинина вируса гриппа осуществляют с полимерами различных составов и молекулярных масс, Используют сополимеры, содержащие !О, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 мол.% акриловой кислоты и с мол, мас. 10000 и 200000. Конъюгат отделяют от несвязавшегося белка и сополимера гель-фильтрацией на колонке с сефадексом, Высушивают лиофильно. Идентифицируют полученные конъюгаты по электрофоретической подвижности, которая отличается от подвиж- . ности гемагглютинина и сополимера. Количест во связавшегося белка определяют с помощью УФ-спектроскопии и методом Лоури, количество ковалентных связей оценивают по результатам спектрофотометрического титрования свободных аминогрупп тринитробензолсульфокислотой. Для иммунологических экспериментов используют конъюгаты, содержащие от 50 мкг до 1 мг гемагглютинина на 1 мг конъюгата с количеством ковалентных связей 5 — 20%.

Установлено, что полученные конъюгаты устойчивы к биодеструкции и выводятся из организма крайне медленно. Эффект вакцины определяется величиной и длительностью протективного действия. В случае устойчивых к биодеструкции соединений длительность воздействия на иммуносистему организма увеличивается. Это важно с точки зрения пролонгирования эффекта вакцины путем увеличения времени циркуляции конъюгата в кровотоке, а также включения новых клонов клеток иммунной памяти. Устойчивые к биодеструкции синтетические полимеры позволяют пролонгировать иммунные и вакцинирующие свойства конъюгатов на их основе.

Пример . Сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона получают методом радикальной их сополимеризации в присутствии радикального инициатора надсернокислого аммония (3) . Состав мономерной смеси определяют с учетом известных констант сополимеризации мономеров. Сополимеры выделяют осаждением в эфир, затем диатизируют и высушивают лиофильно, I

Содержание акриловой кислоты в сополимере определяют ИК-спектроскопии (1720 см " ) и потенциометрическим титрованием. Молекулярные массы оценивают вискозиметрически, Синтез конъюгата проводят по реакции ацилирования в присутствии водорастворимого карбодиимида — 1l-толуолсульфоната-N-цикло-гексил-!ч — (2 (4-морфолиний) зтил) карбодиимида.

30 мг сополимера (мол. мас. 100000, эквимольного состава 50:50) растворяют в

2 мл фосфатного буфера (pH 6,8, ионная сила 0,1 M NaC1), К раствору сначала добавляют 2 мг гемагглютинина в 0,5 мл того же буфера, а затем при перемешивании и

Таблица ) 50

100 32 44 44 44 44 40 40 38 35 34 32 30 25

100 20 30 30 30 30 30 28 28 25 25 24 24 20

100 35 40 40 40 40 37 37 37 35 35 32 25 25

40

60

40 100 100 70 30 20 10 0

Полиамины"

Ф

Для сравнения приведены данные по изменению иммунологической активности по времени конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа на биодеструктируюших носителях - производных гетероцепных полиаминов

3 111575 охлаждении (2 — 4 C) 20 мг карбодиимида в 0,5 мл буфере. Раствор выдерживают в течение 24 ч при перемешивании и охлаждении, затем добавляют 0,1 ммоль ацетата натрия.

Несвязанные ковалентно. белок и сополимер разделяют с помощью гельхроматографии на колоние (1,7х80 см), заполненной сефадексом G-150, скорость элюирования

50 мл/ч, Элюирование проводят 005 М фосфатным буфером (рН 8,2) с ионной силой !ð

1,0 М NaC1. Раствор диализуют через полупроницаемую целлофановую мембрану сначала против 0,15 М NaC1, затем против дистиллированной воды в течение 48 ч. Раствор высушивают лиофильно. !

Количество связанного белка, определенного по методу Лоури и с помощью УФспектроскопии (280 нм), 100 мкг на 1 мг конъюгата. Количество ковалентных связей, определенных спектрофотометричемким титрованием свободных аминогрупп тринитробензолсульфокислотой, 17%.

Сополимеры различного состава и молекулярной массы, а также конъюгаты на их основе различного состава, содержащие различное количество ковалентных связей получены способом аналогичным примеру.

Изучение иммуногенности конъюгата, полученных согласно примеру.

Опыты проводили на мышах. линии СВА и СВАХС57 В /F, весом 22 — 24 r. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно изолированным гемагглютинином, смесью гемагглютининсополимер и конъюгатом гемагглютинин — сополимер. Через 7 — 8 дней после иммунизации в, селезенке животных определяли содержание антителообразующих клеток, используя эритроциты барана, нагруженные вирусом гриппа.

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа против гемаглютинина индуцировали внутрибрюшинной иммунизацией животных изолированным гемагглюнитином, смесью гема люгинина с сополимером или конъюгатом.

В табл, 1 приведены данные о пролонгировании иммуногенности полученных конъюгатов по сравнению с иммуногенностью конъюгатов, полученных по известному способу. Полученные по предлагаемому способу конъюгаты сохраняют иммунологическую активность по крайней мере в течени 18 сут, тогда как, конъюгаты гемагглютинина с производными гетероцепных полиаминов в течение 12 сут.

При исследовании конъюгатов обнаружено повышение иммуногенности в 44 раза (табл.2).

Анализ специфичности указывает на строгую гемагглютинин — специфичность антителообразующих клеток. Иммунизация конъюгатом обеспечивает развитие значительно более выраженной реакции гиперчувствительности, высота которой превышает в 11 раз таковую в ответ на введение изолированного гемагглютина.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получить также конъюгаты гемагглютинина с полизлектролитами, которые обладают лрологированными иммуногенными свойствами, сохраняя при этом высокую иммуногенность, специфичность и способность обеспечить при этом развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа.

1115754

Таблица 2

Количество животных

Доза белка, мкг

Отношение иммунологическойй

Препарат активности

Гемагглютинин

30

100

Коньюгат гемагглютинин — сонолимер 50:50

3500

100

Составитель В. Муронец

Техред М. Надь Корректор С. Черни

Редактор М. Товтин

Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ á805/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Смесь гемаглютинин — сополимер 50:50

Гемагглютинин специфиц. антителообраз.. клетки