Способ выделения мв-изоэнзима креатинкиназы из смеси ее изоэнзимов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУВЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗО6РЕТЕНИЯ, -:

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 27285o7/28-13 (22) 15.02.79 (3 1) 878001 (32) 15.02.78 (33) CIUA (46) 15.01.85. Бюл. Р 2 (72) Джон Артур Бьедж, Майкл Эдвин

Хикей и Гопал Синг Ротела (США) (7 1) Е .И .Дюпон де Немур энд Компани (США) (53) 577.15.07 (088.8) (56) 1. Morin 1. G. Improved Separation of

Creatine Kinase Cordiae tsoensyme in Serum

by Batch Tractionation. — "С1е. Chem", 1976, 22/1, 92-97, / 2. Takahashi К. et a1.Creatine Phosphokinase

Isosymes of Human Heart Musc1e and Ske1eta1

Musc1e.— "C1in. Chim. Arta", !972, 38, 295 — 290.

3. "Biochem G.", 1955, 61, 116, 4. Rosa1ki S.В. An Amproved procedure for serum creatine phosphokinase determIna—

tion. — "The gournal of Labo1atory and Che-.

mica1, Medicine", 1967, 69, N 4, 696.

„.SU„„1135431 A

4 (51) С 12 9 12 G О1 < 33/48 (54) (57) 1. СПОСОБ ВСЕЛЕНИЯ MB-ИЗО

ЭНЗИМА КРЕАТИНКИНАЗЫ ИЗ СМЕСИ ЕЕ

ИЗОЭНЗИМОВ г редусматривающий контак" тирование указанной смеси с ионообменным сорбентом с последующим элюированием, отличающийся тем, что, е целью упрощения процесса, в качестве сорбента используют смесь слабоосновной анионообменной смолы диэтиламиноэтил-замещенного сшитого декстрана и слабокислой катионообменной смолы, представляющей собой карбоксилсодершащий полимер на основе метакриловой кислоты и дивинилбензола с рН 6,0-б,4 и при соотношении смол 1:(5-10), а элюирование осуществляют в изократной среде.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что, в качестве сорбента используют смесь укаэанных смол при соотношении анионообменной смолы к катионообменной 1:6.

111)«31

Изобретение касается сц Особа Выделения ?1В«!(э Оэ(!зи((а креатццкцца зы (СК-?Б) из смеси С?(.-изоэцзимов.

Известны трп !(зоэцзп(«а креатипкиназы, обозначаемые условно. ?(?1— найденньп(первоначально в ске.!етцо— и! (печной(ткани, BB — найденный перво-. начально тв мозговой ткани и МВ найденный первоначально в сердечной ткани. Наличие повьп?(енп(тх уровней 10

?(В- изоэнзима в сыворотке Является показателем инфаркта миокарда, Известен хроматографический способ разделения И1-, ВВ- и ?«!В-изоэнзимов креатицкиназы путем коптактирования смеси указаннь()(изоэцзимов (ГОМОГЕНат тКаНИ ЧЕЛОГЕКа, С. СЦЛ»ЬНОосновной анионообменцой смолой. представляющей собой макропористьп! синтетический пол(отер (марка ЛР(т -1, 20 выпускается фирмой Био-Рэд,)таборатОрИЗ „СШЛ), С ИСПОЛЬ r Oaal!ИЕ.(В Качестве элюецтов трис-НС1 буфера с рП82И69!1).

Известен та1()т»е способ выделe((IIEI 25

?В-ИЗОЭНЗИМа КРЕатппки:(аЗЬ(1»З СМЕСИ ее изоэнзимов путем коцтактирсвания указанной смеси с ионооб!(еп(?ы((и сорбентом — дпэтилам((ноэтl "!- заf Off(el!íüì

cfIITfTbtM декстраном (ДЭЛА-сефадекс З0

A-50} - при рН 7,5 с последующ!Ит! элюированием градиентом ?1аС1 от 0 до 0,5 ?? в 0,5 ?? трпс-11С! буферс рН 7,5 (2?, В этих хроматографт(ческт.(х ме (Одах-55 первым эл!)Ируемь(м изоэпзимо!! т(вляется обычно преобладающц«й ?К-пэоэнз(3к!.

Таким образом, известный способ тре-. бует дополнительного времени и,ополцительпой стадн!1 для Выделения

? (В-изоэнзима креатинк!!пазы.

Цель изобретения — упрощение про-цесса, что достигается за счет элюироэания ??В-изоэнзима в Виде первой фракции из слоя IQHQQGI:eI(I(o(f смолы, ускоряя и упрощая анализ и делая ачализ СК MB более легко прпспосабливаемым для автоматизации.

Указанная цель достигаетс.я способом выделения HB-изоэцзпма креатинки 50 пазы из смеси ее изоэцэ((I(o(l, предусматривающим контактиров ание указанной смеси с ионообмецным сорбентом с последу(ощим элюирово(нием. согласно которокгу, в качестве сорбепта

ИСП4)ЛЬЗУЮ1 СМЕСЬ СЛабОOCI(ODI(OI аНИОнообменной смолы — дпэ т(шам((ноэтилэамеще!Иного с(питого д"-кстрапа и с!(Я()(тт(и(т! {)11 т\ (3-.,—, . i °,*,; « .rr (1!{r r r r то представл(ющ(.й собой катр()()ксть!(Олер)((c3 ((I ? Гсl(rl!Jr . Ц;с (,Стlс " т- .,"f - " . OI(! (ИС. О то! !(»:((;т: {{:«Лбс;(3«(;а,,, т — !!ри CO(rт(»О(О, т(т{т; { МО тЫ 5, 0) а Э.(110!.,)OL»(».!3! (e Осу(1,ЕС.ТВЛ ЯЮ . В 1(т Ократцс-! ср де, В каче-.тве сот)бецта цс;Олт.зу" смесь указанных смол при conтцо,»нии апионообменцой elf{)rl»l к кзтио *.О—

Обмецц«й 1:6.

Выбор -;(ec((смол -I pазлич (L!P параметры зл(оирования, такие как рН, раз(((.?р слОя смольl и Образца, скорость элюи() ОВ ация и т, д, являlот ся в 3 аи:"(О зависи(«((.!м((. В последу!ощем будут ()(тт:.",. e c! I:т с 1(О !(т«1{1)z=(e c J(IIO el(or((,I т(у слоВ. (я, тосксттть(: т Ол!)еде .(е тт выбо!)»-!(е С.,(О rf "f Я От(С»Я, 1;) !! O!(»1(l f:!J т,ЦЬIЕ

»тара! (етр(1 э "!0(rpol»а (ия т"н)гут быт., лег -о «:TpeäåJTCI(ff.

;О-.:Дт (nr! »т» т Е ттв(r(O(({ ? (-(!Ic Ц ({)! l C ({)?(ой

C$lОЯ ЯPS(f(4ТСЯ C."(PC! ДЕ(. ",— ».-1:. -О»Е» (той с!(о!то!(де КГ тр ац(т ВО, ((!3(1(() (() Об;;e! (!! o) f смолы с катионообмецц(ой смолой, В которой pe((el sa акрилового 1(ол((к(ера

З аМЕЩЕЦа КЦСЛОТПОй тт)УЦКЦЦОЦаЛЬНО!т груп (ой. 3 !)о а(rfor(ooб((е(((гая смола ,(?ЕЛЕ; а{) =декс Л--25 и ка; «?О Ооб(.еццая «((О та Био-Гекс 70, Прц цp»;(P (ен!(и с.месь цопооб(OEIцых смс(ц обь(чцо погрул(ае ся В & (,:)ep o рн для смол 6,0-6, (1, 1 рц нкокцем пределе pH ?«(«(— и BB 1?зов(!Ви;,«.? oo»leе

ЛЕГКО За(1ЕРЯИВа!От{?Я С((О!(ой. ПРИ ВЕРХнем предел(- рН более легко этпоируется МВ 11 - os!I .<(1м, !!О :"анже прОисхОдит некоторое этпоцрован(ие ВВ-пзО,E(s!1;-:а.

Иод изократ (От", средо((э!(д(рова!Л(я

ПОДР -!» y МЕВ а{ = т С я ЧТО и OH .тая СИЛа

ЭЛIОЕцта ВОДЬ! 1(!!И Р атц 1(тЧП(ЫХ GV(c:Е?) !ЬЬ(Х растворов пе изменяется;» и,-.оцессе хро.(атогра(()1-!и, Вид поцооб:"(е:итого сорбента, Определенный Вь".е и поттготовлеццый к анализу с помощью буфера, :GeСПЕтlI;EIаЕт ИЗOКРàr HÓÂ СРЕДУ ЭЛЮИРОнация, удельная проводим:сть и зца"!el?I»p p J1 С(y I 4«1.»т,! Ol!)i eд : 4«)(0 J уо;!О!Зця сорбции и эт?10!В(13. (".ЛОСОбт ОСущЕСТВЛЯЕТСЯ т!4ду(сщИМ

Образом, ДЕЛЕ-Сафедекс Л-25 гидратируется

В буфере, предло -!(итсль!(О в; (орфолинэ-..!Лсуль{1)окислоте, доведенцо и до

pí 6,0, в те ение»18 ч. В конце этого I:åpèîäà pIf снова доводят до 6,0 с г(оь(О(!(ь({) НС4 . БИΠ— ))екс 70 (100200 fe.I() (О, 1А(9-0,07 -: мм размер

1135431

Т а б л и ц а 1

134

196

286

197

361

785

3 отверстия по ASTM) гидратируется в том же буфере, доведенном до рН 6,0, в течение того же периода времени, после чего рН повторно доводят до

6,0 едким натрием. Тонкие частицы удаляют из обеих смол, один объем слоя Сефадекса добавляют к шести объемам слоя Био-Рекс при спокойном перемешивании, которое продолжают

15 мин, рН цоводится до 6,0. Слой смолы промывают тремя объемами буфера (по сравнению с объемом слоя), доведенного до рН 6,0. Смолу оставляют погруженной в буфере рН 6,0. В этих условиях элюентом, применяемым для элюирования СК-МБ из колонки, является деиопизированная вода. Эти условия являются предпочтительными для приспособления метода разделения к аналитической набивке, примеилемой О на автоматическом клиническом анализаторе (AKA), продаваемой фирмой

"ЕИ Дюпон де Немур энц Компани".

Н р и и е р 1. Колонки коллекто ров анализатора AKA объемом 1,7 мп набивают смесью Био-Рекс 70 и ДЕЛЕ

Сефадекс A-25, приготовленной, как указано. Каждая набивка приспособле:га для приема одного образца объемом

0,34 мл, впрыскиваемым на смолу колонки. Образцы элюируют 2,0 HJI деионизированной воды в реакционной камере насадки со скоростью

1,0 мл/мин.

Присутствие креатинкиназы в элюенте определяется по модификации УФэпзиматического анализа, описанного

Оливером И .Т (3.1 и Розалки С.Б. (4Д.

Скорость образовапия БЛД11,, который поглощает нри 340 нм, пропорциональгга концентрации креатинкиназы.

Изоэнзимы (rr чело- Активность колонки веческой сыворотке) ME/ë, (вес/объем колонки) 4

Эффективность хроматографического разделения изоэнэимов может быть продемонстирована следующим образом.

Извлечение трех пзоэнзимов креатинкиназы может быть определено путем измерения их индивидуальной активности до и после элюирования через колонку со слоем смешанной смолы.

Источником изоэнзимов, применяемым для этих определений, является человеческая ткань. В табл, 1 представлено типичное извлечение изоэнзимов с применением колонки со слоем смешанной смолы, как указано.

Пример 2 ° При применении той же смеси ионообменных смол и колонки такой же величины с образованием 0,20 мл и элюировании колонки объемом 2,0 мп деионизированной воды со скоростью 0,5 мп/мин на сорбенте задерживаются почти полностью СК-ИИ и и С1(-ВВ, тогда как элюируется только

СК-И1В-изоэпзим. Влияние рН смолы на работу колонки со слоем из смешанной смолы в этих условиях показано в табл, 2.

В табл. 3 дана зависимость результатов элюции от соотношения используемых смол.

Как видно нз табл. 3, наиболсе предпочтительным при выделении ИВизоэнэима креатинкиназы является соотношение апионообменной смолы к катионообменной 1:б.

Изобретение позволяет значительно упростить процесс выделения ИВ-иэоэнзима пз смеси изоэнзимов за счет выделения ИВ-изоэнзима первым пз указанной смеси.

Активность, МЕ/л Извлечение, Х объем колонки

1 135/(31 ((Aктиен0ст(; .

Колонка в ес f (:бъем Кодо . к «

I к i) л о i I;.i -"

6., 25

C) 107 I 3

95 вв

1:б

l- 0

/>9

° 9 (/ 7 (00

1:11 и кави тел -, 0 Гко оо (т, -,(оg «

Редактор О.Колесникова Те хред Q,öi де I.(.ð)-:i . «t (-.ð;. Ãÿñêî

Заказ 10109/4б 7 BK;25

ВНИИПИ Государственного комите а С(. СР по делам изобретений и о.iк-:-.«(.1гий

113035, Москва, %-35, Раушская наб.. д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r Ужгород/ y. (. Проектная, /

Изоэнзимы (в челове че ской сыв оротке) Соотношение анионообменной смолы к катионообменной (рН 6,0) Выделение

"H-изознзима

/ о/ (ь загрузки

90 ИЕ/л)

1 "1-, р,;ад ( """:4 "-; .. n -. (/ x (7 . :«груз cи