Способ производства лиофилизированной вакцины против гепатита уток

 

союз СОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК и 4 С 12 11 7/00, А 61 К 39/29

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ / ;, ..., /

К ПДП=НТ У

/ (21) 3524763/30-15 (22) 22, 12. 82 (31) 3935/81 (32) 23.12.81 (33) HU (46) 07,06.86.Бюл. Р 21 (71) Филаксиа Олтоаньагтермеле Валлалат (HU) (72) Эржебет Хорват и Габор Толлаш (HU) (53) 615.371/.372:616,36-002.636 597 (088.8) (56) Ветеринарные препараты.-N. Колос, 1981, с.139-140. ° (54)(57) СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГКПАТИТА

УТОК, предусматривающий культивирование вакцинного вируса гепатита уток на эмбрионах, добавление в полученный вирусосодержащий материал антибиотиков и защитной среды с после„„SU„„1237081 A 3 дующей лиофилизацией полученной суспензии, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности вакцины из вакцинных вирусов гепатита используют штамм

ТМ Р 00220, иэ эмбрионов применяют куриные, после культивирования вируса гепатита куриные эмбрионы гомогенизируют в присутствии физиологического раствора хлористого натрия при содержании эмбриомассы и физиологического раствора, соответственно равном 25-35 и 65-75 об.Е, центрифугируют, в качестве вирусосодержащего материала используют надосадочную жидкость гомогената, а в качестве защитной среды — смесь, содержащую 0,57. поливинилпирролидона, 0,5Е желатины, 2Х глюкозы, 1,57. сахарозы от вирусосодержащей суспензии.

1237081

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к

° способам производства лиофилизированной вакцины против гепатита уток с применением культивируемого по Асплину ослабленного гепатитного вируса TN.

Цель изобретения — повышение активности и стабильности вакцины.

Культивируемый по методу Асплина ослабленный гепатитный вирус TN, хранящийся под номером 00220 в фондах венгерского сельскохозяйственного института эдравоохранения (ОК1), инъецируют в аллантоисную полость куриных яиц, Яйца инкубируют при температуре о

37 С, собирают погибшие в течение

24-96 ч инкубации, а оставшиеся в живых эмбрионы, уничтожают в случае не. обходимости удаляют в стерильных ус ловиях твердые ткани, затем гомоге.низируют эмбрионы в стерильном физиологическом растворе хлористого натрия, центрифугируют гомогенизат, вводят антибиотик в прозрачную суспензию и лиофилизируют жидкость,известным способом после добавления в нее защитных коллоидов и структурообразу-. ющих веществ.

Под SPF-яйцами понимаются яйца, не содержащие возбудителей Avian

encephalomyelitis чумы птиц, ЕДБ, бронхита, лейкоза А-В, Gumboro, Ma-

rek, реовируса, а также Salmonella

Gall, Salmonella typhinurium, Hycoplasma Gall, Мусор1азтаа Synoviae или их антител.

При гомогенизации разбавляют суспензию предпочтительно в таком соотношении, чтобы содержалось 25-35 об.7. эмбрионной массы и 76-65 об.X физиологического раствора хлористого натрия °

В качестве защитного коллоида и структурообразующего веществапредпочтительно используют комбинацию поливинилпирролидона, желатины, глюкозы и сахарозы.

При лиофилизации полки устройства для лиофилизации, предназначенные для укладки материала, охлаждают до

0 — (-б) С, а материал, находящийся .на полках — (-30) — (-40) С, после окончания сублимации полки нагревают до 30-40 С и сушат материал в течение 4-10 ч. 10

t5

Пример 1; БРГ куриные яйца инкубируют в течение 10 сут, затем просвечивают и отмечают положение воздушной камеры и эмбриона на яичной скорлупе. Затем тупой конец яйца дезинфицируют. Суспензию инфицируемого вируса через проделанное над воздушной камерой отверстие вводят в аллантоисную полость. Инифицируемый. материал содержит в одном миллилитре

50000 Е105 . На одно яйцо используется 0,2 мл инфицируемого материала, Затем в отверстие закрывают при помощи парафина и яйца инкубируют в инкубаторе при 37 С. Яйца просвечиваются каждый день и яйца, содержащие погибшие эмбрионы,,хранятся до их о дальнейшего применения при 2-5 С. Оставшиеся в живых после 96 ч от инкубации эмбрионы уничтожаются, Змбрионы извлекают в стерильных условиях ихяиц,отрезают переднюю часть головы и измельчают. Затем до-. бавляют физиологический раствор хлористого натрия, продолжают гомогенизацию в гомогенизаторе. 1. 1accy подвергают дальнейшему разбавлению, пока количество добавленного солевого раствора не составит 707 от полученной суспензии. Суспензию центрифугируют в течение 20 мин при скорости

3000 об/мин. Прозрачный супернатант фильтруют через четыре слоя стерильной марли.

Полученный материал подвергают пробе на чистоту и сразу же за этим подвергают обработке антибиотиками (пенициллил, стрептомицин, неомицин и хлороцид). Суспензию выдерживают при комнатной температуре в течение одного часа, а затем проверяют на стерильность, высевая на питательную среду.

Если материал окажется не стерильным, его стерилизуют гентамицином. Не позже 5-6 сут после нарушения целости скорлупы суспензию лиофилизируют. До того времени суспензию хранят при 4 С. Перед лиофилизао цией добавляют следующие защитные вещества.: 57 10 об,%-ного коллидонового раствора, 57 10 o6.X-ного раствора жел:тины,, 47 50 об,X-ного раствора глюкозы и .37 50 об,7-ного раствора сахарозы.

Общее количество защитных колло.идов и структурообразующих веществ

1237081 составляет 17Z. Перед лиофилизацией определяется титр суспенэии—

10 Е!Р /мл.

Суспензию расфасовывают порциями по 2 мл в стаканчики. Их размещают на предварительно охлажденных до о

-5 С полках устройства для лиофилизации. Когда температура материала о опустится до -45 С, включается вакуум, После того, когда давление со- !О ставляет 0,1 мбар, включается нагрев полок и регулируется таким образом, чтобы температура материала держалась в пределах (-30) — (-35) С (при

0,1 мбар для этого необходима темпе- !5 ратура полок около — 15 С). По оконо чании сублимации полки нагревают до о

35 С и устанавливают максимальную производительность вакуум-установки.

После сушки в течение 8 ч остаточное 2р количество влаги составляет менее 2Z, Стаканчики еще в установке для лиофилизации под вакуумом закрывают герметично резиновыми пробками с металлическими колпачками. 25

Пример 2. Для получения инфицируемого вируса повторяют методику, изложенную в примере 1, с тем отличием, что в суспензию не добавляют антибиотик, а готовую вакцину не лиофилизируют, хранят в замороженном состоянии в жидком азоте, Титр инфицируемого вируса составляет по меньшей мере 10 -10 Е10 р /мл. Перед

6,5 7 применением из инфицируемого материа- З ла готовят разбавленный раствор в соотношении 1:60-1:200. Одна прививочная доза (0,2 мл) содержит примерно 10000/EID) . Инфицируемый вирус не должен вызывать гемаглютинизацию 40 красных кровяных шариков кур.

Пример 3. Иммуногенность оценивают в реакции нейтрализации.

Для эксперимента используют 480 утят из хозяйства, в котором вследствие экспортных поставок поголовье не под-. вергают иммунизации. Каждая группа состоит из 20 птиц.

В эксперименте с вакцинацией применяют буфер следующего состава,г: 50

NaC1 8

КС1 0,2

11а НР04.2Н О 1,15

2 РО 0,2

Сас! 0,1 55

NgC1 ° 6Н О 0,1

Дистиллированная вода До 1000 мл

Из полученной по методике примера

1 вакцины с помощью буфера приведенного состава получают разбавленные растворы различной концентрации. Эти растворы применяют как для внутримышечных инъекций, так и в питьевой воде. С целью сравнения проводят аналогичные эксперименты с коммерческой жидкой вакциной.

Через 12 сут отбирают пробы крови и сыворотки, инактивируют при о

56 С в течение 30 мин. Затем разведение сыворотки в соотношении 1:10 проводят в контакт с различными разведениями вируса и выдерживают при комнатной температуре в течение одного часа, а затем полученной смесью инфицируют инкубированные в течение

11 сут SPF яйца. Титр вируса или индекс нейтрализации (ИН) определяют после истечения одной недели по количеству погибших или еще живущих, но подвергшихся характерным патологическим изменениям, эмбрионоц по методу Риид-Мюнха.

Сравнительные данные по иммуногенной активности замороженной жидкой вакцины и предлагаемой вакцины приведены в таблице, Индекс более 2 является положительным, индекс более 3 является отличным результатом..

Hs таблицы видно, что полученная по согласно предлагаемому способу вакцина имеет отличные защитные качества, Пример 4. Способность вакцины к хранению исследуют посредством моделирования действительного хранения, а также посредством обычной тепловой нагрузки. При моделировании условий хранения исходят из того, что в инструкциях болыпинства стран предписывается способность к хранению при 4 С, поэтому способность к хранению предусмотренного на экспорт продукта проверяют при этой температуре. Хранившаяся в течение

12 мес при 2 — 5 С вакцина теряет о

0,6 десятичных степени своей активности. (от показателя степени значения E!D> ). Эта величина незначительна и не превьппает разброс величины EID60 двух колбочек °

Проба с тепловой нагрузкой обеспечивает в достаточной мере быструю проверку. Если титр хранившейся в течение одной недели при 37 С вак1237081 цины является удовлетворительным, то гарантированным является то, что при хранении в течение года в предписываемых условиях она является пригодной для применения..Полученная согОтличие от контроля, Е

Доза, Е10ур

Обработка

1,6

Контроль

Замороженная жидкая вакцина, подкожно

87,5

613

3,6

6130

125

158

62,5 подкожно

4,6

187,5

4,8

15850

200 в питьевой воде

3160

131

31600

175 ч,б

316000

187,5

Составитель И,Тареева

Техред О.Сопко Корректор A.Îáðó÷àp

Редактор Н.Рогулич

Заказ 3103/60 Тираж 4 90 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие„г,Ужгород, ул.Проектная,4

Лиофилизированная вакцина согласно предлагаемо" му способу ласно предлагаемому изобретению вакцина при хранении в течение одной недели при 3? С теряет только 0,5 десяо тичных степени своей активности, что является отличным результатом.