Способ получения рибои дезоксирибонуклеозид-5 @ - трифосфатов, меченных изотопами @ с и @ н

 

СОЮЗ СОЕЕтСНИХ социАлистичесних

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1251509 A 1 (51) 4 С 07 Н 19/10 19/20

sP, г .

,,с— ф л /!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СОИДЕТЕЛЬСТВУ

Изобретение относится к области биоорганической химии, конкретно к способам получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфатов, меченых изотопами "С и Н, которые щироко применяются в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях.

Целью изобретения является упрощение процесса и повьыение выхода целевого продукта.

П р и и е р I. Получение комплексного ферментного препарата.

Биомассу Е. coli В, инфицированную мутантным фагом Т4 am I 82 (с множественностью зара кения 4), хранящуюся при -40 С, измельчают в ступке, заливают трехкратным объемом 0,1 М КС1 и

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET

flo иэОБРетениям и ОтнРитиям

flpH ГКНТ СССР (21) 3782233/23-04 (22) 17.08.84 (46) 15.10.89. Бюл. Ф 38 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) С. А. Феофанов, С; Н. Загребельный, О. П. Мокану и А. P. Чудинов (53) 547.455.07(088.8) (56) Е. S. Canellakis, М. Е. Gottesшап, Н. О. Kasmen. Biochim, Biophys.

Acta, 1960, ч. 39., р. 82-87. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБО- И ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИД-5 -ТРИФОСФАТОВ, MEQEHblX ИЗОТОПАМИ "С И К, включающий выделение и очистку ферментного препарата, содержащего ферменты: ацетокиназу, нуклеозиддифосфаткиназу, (деэокси) аденилаткиназу, (дезокси) гуанилаткиназу, (дезокси) цитидилат2 кииазу, уридилаткиназу и тимидилаткиназу, иэ.биомассы Е. coli, фосфорилирование рнбо- и девоксирибонуклеоэид-5 -монофосфатов, меченных иэотопами ! С или Н, с помощью ферментного препарата с добавлением в реакционную

$+ смесь ионов Mg „ ацетилфосфата, АТФ или дАТф и буфера.тряс-НС1 рН 7,5, о т л и ч а .ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повыиения выхода целевого продукта, все указанные ферменты использую". виде иммобилизлванного на Вг-CN-Се ароэе комплексного ферментного препарата, выделенного иэ биомассы K. cali В, инфицированной мутантным фагом Т4 ал 11 82, обработкой клеточного экстракта стрептомицинсульфатом и последующим фракционированием сульфатом аммония при концентрации его 70-302 от насыщения.

0,05 М .трис-НС1 рН 7,5, содержащем веый

2 мМ 2-меркаптоэтанола, перемешивают при 2-5 С до образования однородной р суспенэии, затем приливают раствор лизоцима в 0,05 М трис-НС1 рН 7,5 (иэ расчета 1 мг лизоцима на 1 r биомассы) и перемешивают при 2-5 С в течео ние 10 мин. После этого суспензию озвучивают в ледяной бане на ультразвуковом деэинтеграторе (18 кГц) сеанса- а ми по 1 мин с перерывами в 1 мин. Общее время озвучивания 20 мин. Суспенз г центрифугируют в течение 40 мин при 10000 об/мин, Осадок отбрасывают.

К супернатанту приливают по каплям при тщательном перемещивании ЗОХ-ный раствор стрептомицинсульфата в 0,05 М

I 25 I 509 трис-НС1 рН 7,5, содержащем 2 мМ 2— меркаптоэтанола, до конечной концентрации стрептомицинсульфата 3Х. После

С этого смесь перемешивают при 2-э С н

5 течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 40 мин при 12000 об/мин, Осадок отбрасывают. К супернатанту при тщательном перемешинании на холоду присыпают небольшими порциями тонкорастертые кристаллы сухого сульфата аммония до конечной концентрации 70Х насыщения по сульфату аммония. Раствор тщательно перемешинают н течение

30 мин на холоду, а затем центрифугируют н течение 30 мин при 10000 об/мин.

Супернатант отбрасывают. Осадок суспендируют н минимальном объеме растнора сульфата аммония с концентрацией

70Х от насыщения н 0,05 M трис-НС1 рН 7,5, содержащем 2 мИ 2-меркаптоэтанола, Суспенэию раэбанляют в 2,5 раза с буфером и тщательно перемешивают на холоду в течение 20 мин, затем центрифугируют в течение 30 мин при 25

12000 об/мин. Осадок отбрасывают.

Супернатант подтитровынают с 0,5 н

КОН до рН 7,5 и используют как комплексный ферментный препарат. Полученный ферментный препарат разливают по

5 мл н герметичные полиэтиленовые флаконы и заморажинают при -40 С. В таком виде препарат хранится 6 мес. беэ заметной потери активности.

Пример 2. Синтез рибонукле35 оэид- и деэоксирибонуклеоэид-5 -трифосфатов, меченных иэотопами С и

14

Н, с использованием комплексного ферментного препарата.

Перед использованием н синтезе комплексный ферментный препарат иммобилиэуют известным способом на Br-CtkСефароэ е, Для этого 5 мл ферментного препарата раэмораживают на льду, обессолинают (от сульфата а .моння)

45 на колонке с Сефадексом Г-25 (1,6 см х х 40 см) с одновременной заменой бу фера на 0,1 М К-фосфат рН 7,8, содержащий 0,5 М КС1 и 2 М1 2-меркаптоэтанола. В последнем буфере проводят иммобилизацию при соотношении белка

50 и матрицы 15 мг/г сухой матрицы. Хра нят иммобилизонанный ферментный препарат (ИФП) в 0,01 M трис-НС1 рН 7,5, содержащем 2 м11 2-меркаптоэтанола, при 2-5 С н герметичной посуде в течение 4 недель без потери активно сти. а) Синтез уридин-5 — трифосфата.

Реакционную смесь, содержащую н

I мп 2 мкмоль "С- или Н- уридин-5 —

-монофосфата 0,2 мкмоль АТФ, 20 мкмоль ацетилфосфата, 4 мкмоль

MgC1q 50 мкмоль трис-HCl рН 7,5, ИФП, содержащего 0,4 мг белка, инкубируют н термостатируемой нстряхинаемой кювете при 37 С и течение 2 ч.

Затем реакционную смесь отделяют от

ИФП на стеклянном фильтре, упаривают при 30 C на ротационном испарителе до объема около 0,1 мл и наносят на пласт) ны Силуфола УФ-254 (15 см х х 15 см), предварительно промытые ацетоном и высушенные н вакуумном эксикаторе. Проводят восходящую хроматографию в системе 1,4-диоксан — 5 M аммиак — I М ацетат аммония (43:54:3)

Зоны расположения нуклеотидного материала идентифицируют под ультрохемископом; полосы, содержащие мС- или

И-УТФ, вырезают и элюируют С- или

Н-УТФ с пластины водой. Элюат фасуют во флаконы, добавляют этанол до концентрации 50Х и хранят при -20 С.

Выход 4C или ll-УТФ в синтезе составляет 94-96Х. б) Синтез аденоэин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль " С- или Н-аденозин-5 -монофосфата, В остальном про1 цесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход 4С- или Н-АТФ в синreзе составляет 82-89Х в) Синтез гуаиозин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль С- или эН-гуанозин-5 -монофосфата. В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата, Выход 4С- или - НГГФ в синтезе составляет 82-89Х. г) Синтез цитидин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль мС- или эН-цитидин-5 -монофосфата. В остальном про; цесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход 4С" или Н-ЦРЭ в синтезе составл:.ет 70-72Х д) Синтез деэоксиаденоэин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субсТрата используют 2 мкмоль и С- или Н-дезоксиаденознн-5 -монофосфата. Вместо

ЛТФ в качестве донора фосфатных групп в реакционную смесь вносят дАТФ. В

l25I509

Составитель Ю. Голова

Редактор Н. Корченко Техред 11.Коданич Корректор В. Кабаций

Заказ 6865 Тираж 339 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход мС- или Н-дАТФ в синтезе составляет

8l-83Х.

1 е) Синтез деэоксигуаноэин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль С- или Н-дезокси-lp гуанозин-5 -монофосфата. В остальном

1 процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридии-5 -трифосфата. Выход 4С- или Í-дГТФ в синтезе составляет 90-92Х. ! ж) Синтез дезоксицитидин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль "C- или Н-дезоксицитидин-5 -монофосфата. В осталь- 20 ном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5 -трифосфата. Выход 4Сили Н-дЦТФ в синтезе составляет 6265X. 25 ( з) Синтез деэокситимидин-5 -трифосфата.

В качестве меченого субстрата используют 2 мкмоль С- или Н-дезокситимидин-5 -монофосфата. Хроматогра- ЗО фию реакционной смеси на пластинах

Снлуфол УФ-254 проводят в системе изомасляная кислота — 5 H аммиак вода (57:4:39). Полосу Сипуфола УС

254, содержащую С- или эН-ТТФ промывают зтанолом для удаления следов изомасляной кислоты, высушивают и эатем злюируют целевой продукт водой. В остальном процесс синтеза и очистки конечного продукта аналогичен описанному для уридин-5-трифосфата.

Выход "С- или Н-дТТФ в синтезе составляет 88-82Х.

Радиохимическая чистота полученных препаратов составляет 94-96Х. Основные характеристики Учспектров полученных рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозид-У -трифосфатов соответствуют характерньи для них. Полученные препараты +С-АТФ и «C-УТФ были испытаны в ферментативной системе PHK-полимеразы Е. coli, а препарат 4С-дТТФв системе терминальной дезоксинуклеотидилтрансфераэы иэ тимуса теленка.

Во всех случаях включение полученных 4 С-нуклеозид-5 -трифосфатов не уступает включению аналогичных препаратов фирмы "Amersham".