Натриевая соль -амино- (метилтио)пропилфосфонил -5- аденилата для избирательного ингибирования ферментов биосинтеза белка в клетке и способ ее получения

 

)

О П И С А H И Е < !673290

ИЗОБРЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Свюз Советских

Свциалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 18.07.77 (21) 2508261/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Пр иор и тет— (51) Л!.Кл.-"С 07 H. 19 20//

А 61 К 31/00

4Ъсударствеииый кемитет (43) Опубликовано 30.03.80. Бюллетень |Ъ 12 (53) УДК 577.159 (088.8) 00 делам изсбретеиии и открытий (45) Дата опубликования описания 30.03.80 (72) Авторы изобретения

А. И. Бирюков, И. А. Гандурииа, Т. И. Осипова и P. М. Хомутов

Институт молекулярной биологии AH СССР (71) Заявитель (54) НАТРИ ЕВАЯ СОЛЬ (а-АМИ НО-!г-(МЕТИЛТИО)ПРО П ИЛФОСФО Н ИЛ)-5 -АДЕН ИЛАТА

ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ИНГИБИРОВАНИЯ

ФЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА В КЛЕТКЕ

И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому химическому соединению — натриевой соли смешанного ангидрида аденозин-5 фосфата (АМФ) и а-амино-у-(метилтио)пропилфосфоновой кислоты формулы:

ХН2 у о о

4х - $-CHg-сн g — сн — Р— о — Р— о — CH.g х м

I !0 .мнт отче ома н яО он ингибитору биосинтеза белка в клетке и способу ее получения.

Известны эфиры аминоспиртов и АМФ, обладающие сродством к ферментам. Однако они не являются высокоспецифичными ингибиторами ферментов.

Натриевая соль (а-амино-!г- (метилтио)— пропилфосфонил)-5 -аденилата специфически тормозит активацию метионина.

Цель изобретения — синтез нового соединения, натриевой соли (а-амино-,-(метилтио)-пропилфосфонил)-5 -аденилата для избирательного ингибирования ферментов биосинтеза белка в клетке.

Известен способ получения диэфиров фосфорной кислоты з присутствии дициклогексилкарбодиимпда с небольшим количеством воды. Однако этот способ для получения целевого продукта требует введения и снятия защиты с различных функциональных групп, что осложняет процес в связи с присутствием серусодержащих соединений (инактивация катализатора реакции гндрогенолпза) и лабнльностью ангидридной связи.

Способ получения натриевой соли (аамино-!г- (метилтио) - пропилфосфонил) - 5 аденилата, согласно изобретению, заключа ется во взаимодействии а-амино-!г (метилтио) -пропилфосфоновой кислоты с АМФ в присутствии ДЦК в водном пиридине, содержащем соляную кислоту.

Пример 1. Натриезая соль (а-аминоу- (метилтпо) - пропплфосфонил) - 5 - аденп20 л а та.

0,092 г (0,5 л.гго.гь) а-амино-у-(мстилтио)-пропилфосфоновой кислоты и 0,173 г (0,5 г!.гго.гь) аденозин-5 -фосфата суспендируют в 1,5 .гг.г 1 н. соляной кислоты, прпоаз25 ляют 5 г!.г пирпдипа, затем раствор 2,06 г (10 яяоль) М,X"-дицпклогексилкарбодиимида в 8 я.г пир.!дина и перемешивают

30 ч при 20 С, фильтруют, осадок промывают .ппридпном (2к3 .1г.г), водой (2 :3.!!.г) фильтраты упаривают з вакууме. добавля671290

Ингибнрован, 4е К;,. 1) реакция с>4

АтФ ФФ4 реакция аняиноацилирования обмена

ТРНК

E5,ì..нецнл-тРНК-с«н ета згя 1 10

4,1 10

0 10 — 7

6, 10 — з

2 10 — 3

5 1О

Валил-тРНК-синтеаза

Фенилалан«л-тРНК-с ин геаза

Метионнл-тРНК-си«теаза

Х(Ф вЂ” адеиозинтрифосфа r; ФФ„: — пирофосфатньяй об

Уголь отфильтровывают, промывают 100 м,г воды и элюируют 2%-ным спиртовым раствором триэтиламина. Злюаты упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в

1 мл метанола и добавляют раствор 0,06 г (0,5 ммоль) перхлората натрия в 1 мл метанола. Выпавший осадок отфильтрозывают, промывают спиртом и выделяют целевой продукт препаративным электрофорсзом на бумаге ФН-18 в буфере 0,05 М ацетат натрия, рН 4,1 при:- ап1ря;:кении 4000 В.

Полосу с подвижностью +0,76 относительно АМФ элюируют при +4 — 4,5 С, элюат 15 лиофилизуют, остаток промывают абсолютным метанолом, эфиром и сушат в вакууме над Р20„.-. Выход натриевой соли а-аминоу - (метилтио) - прапилфосфонил-o — аденилата 0,067 г (25%), UAìô = +0,76, 0 (=-„;, = 13250, рН 7). На хроматограммах и электрофореграммах поглощающее в УФ пятно окрашивается нингидрином, вещество окисляется периодатом натрия до соответствующего диальдегида (ггис-гликольная 5 группировка) и при гидролизе lн. соляная кислота, 100 С, 10 мик) дает только аденозин-5 -фосфат и а-амино- (у-метилтио) -пропилфосфоновую кислоту (наличие ангидридной связи).

Исследовалось влияние (а-амино-у-(метилтио)-пропилфосфонил)-5 -аденилата на реакции, катализируемые валилфенилаланпл- и метионил-тРНК вЂ” синтетазами из 35

E. col i В.

В ходе этих реакций основными промежуточными соединениями являются соотв.тственно валил-, фенилаланил-, метио- 40

-нпл-5 -аденилаты. Фосфонатным аналогом последнего из ннх является целевой продукт, что подразумевало специфическое тормоя<енпе только метионинового фермента. Результаты представлены в таблице. 45

Ингибирование аминоацил-тРНК-синтетаз (а-амино-у- (метилтио) -пропилфосфои ил)-5 -аденилатом

Как видно из данных таблицы (а-аминоу- (метилтио) — пропилфосфонил)-5 -адени— лат дейсгвует в случае метионил-тРНКсинтетазы на 3 — 4 порядка лучше, чем по отношению к други. ферментам.

Пример 2. Ингибирование метионилтРНК-синтетазы натриевой солью (u-амино/-(ьметилтио) - пропилфосфонил) - 5 - аденилата.

Мстионил-тРНК-синтстазу Е. coli В получают, а мзтпониновую тРНК из суммарной тРНК E. coli В очищают известными методами. При определении активности фермента использова IH ЛТФ-NB соль, Восстановленный глу атион С"-1 -метионин (56 Ки/лоль) Р"-пирофосфат натрия (10 Ки/л1оль), активированный уголь

Хог11 А трис . НС! и 6-меркаптоэтанол и остальные вещества коммерческой чистоты без предварительной очистки.

Ингибирование реакций аминоацилирования тРНК и АТФ вЂ” ФФ обмена проводят в стандартных условиях при 37 — 37,5 С в течение 15 лин. 50 мкл 9 10 з — 9. 10 -зМ раствора (а-амино-у- (метилтио) -пропилфосфонил)-5 -аденилата вносят в инкубационную пробу непосредственно перед добавлением фермента. Инкубационная смесь содержит в пересчете на 0,5 мл: 0 лгкмогь трас. НС! (рН 7,4), 5 мкмоль хлористого магния, 5 мкмо гь хлористого калия, 1 мкмо гь Boccl à Ioâëåííoão глутатиона, 1 мкмоль АТФ, 10 нмоль С"-L-метионина, 0,2 лгг rPHK и 0,007 мг фермента. Выход

С 4-метионил-тРНК определяют по известному методу.

Скорость АТФ вЂ” ФФ, обмена определяют в реакционной смеси, содержащей в 1 мл:

100 мкмоль трис НС! (рН 8,0), 5 мкмоль хлористого магния, 100 мкмоль фтористого калия, 10 мклоль P-ìåðкаптоэтанола, 2 мкмоль ЛТФ, 2 лчкмоль P 2-ïèðoôocôàòà натрия, 0,015 мк фермента. Пробы анализируют пз вестным методом. Константа ингибирования метионил-тРНК синтетазы в реакции АТФ вЂ” ФФ; обмена равна К; (М)

9. 10 7, в реакции аминоацилирования тРНК К, (М1 5 10

671290

Формула изобретения

Составитель Л. Никулина

Тскрсд В. Серякова

1(оррсктор С. Файн

Редактор Е. Месропова

Заказ 236/337 Изд. ¹ 228 Тираж 497 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тнп. Харьк. Фил. пред. «Патент»

1. Натриевая соль (а-амино-у- (метилтио) -пропилфосфонил)-5 -аденилата формулы: ту

2т о о в и (II

Сн - "-.— 0н: — бн - он-v — о -з — 0 — .—..:;

1 о

11Н т Ол1а 0> д,(- 1 для избирательного ингибированпя ферментов биосинтеза белка в клетке.

2. Способ получения соединения по п.

1, отличающийся тем, что ааминоу- (метилтио) -пропилфосфоновую кислоту конденсируют с аденозин-5 -фосфатом в присутствии Х,N -дициклогексплкарбодиимида B водном пиридпне, содержащем соляную кислоту.