Способ количественного определения радиоактивных метаболитов стероидов

 

Изобретение относится к химии и биохимии природных соединений,предназначено для количественного определения радиоактивных органических со- . единений, в частности стероидных гормонов . Цель изобретения - повьшение точности и ускорение способа.. Для этого получают гомогенат адекомы предстательной, железы человека в 0,05 ммоль -лфосфатном буфере, рН 7,4, С н 5 о -дигидротестостерон при концентрации 100 наномолей-л инкубируют с гомогенатом аделомы предстательной железы в п рисутствии Ь- i глюкозы, глюкозо-6-фосфата,.НАД Н и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в течение 30-90 мин при . Общий объем пробы 75-100 мкл. К пробам добавляют 25-50 мкл 1 Н.НС1, стероиды : 5с -андростан-Зс, 1 7/з-диол, 5ci -андростан-Зо, 17/1-диол, 5с -дигидротестостерон и лиофилизуют. К остатку добавляют 50- 100 мкл смеси бензолметанол (1:1) и хроматографируют пробы в системе растворителей бензол:ацетон: этиловый спирт (9:1:0,5)с Пластинки высушивают , опрыскивают.проявляющей смесью: ледяная уксусная кислота - концентрированная серная кислота - анисовый альдегид - метанол (25:1:3:71) , нагревают 5-7 мин до 100-1Ю С, Соответствующие нужным метаболитам зоны вырезают вместе с алюминиевой подложкой , помещают в сцинтилляционный флакон , заливают сцинтилляционной смесью , радиометрию идентифицированных зон ведут, помещая в сцинтилляционную жидкость слой силикагеля с алюминиевой подложкой. (Л со сд со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 G 01 N 33/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Ъ. „

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3660372/28-14 (22) 05. 11 ° 83 (46) 07.06.87. Бюл. ¹ 21 (71) Центральная научно-исследовательская лаборатория Четвертого главного управления при Министерстве здравоохранения СССР (72) В.Г. Дегтярь, Н,Е. Кушлинский и Ю.В. Милосердов (53) 612.018(088.8) (56) N.Ñ. Thien et.а1. J ° Stегоid

Bicchem, 1975, № 6, р. 1165-1169. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАДИОАКТИВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ СТЕРОИДОВ (57) Изобретение относится к химии и биохимии природных соединений, предназначено для количественного определения радиоактивных органических со-, единений, в частности стероидных гормонов. Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа. Для этого получают гомогенат аденомы предстательной. железы человека в

0,05 ммоль .л-" фосфатном буфере, рН

7,4, (Н ) 5 с(-дигидротестостерон при концентрации 100 наномолей-л ин„.SU, 1315903 А 1 кубируют с гомогенатом аденомы предстательной железы в присутствии Ьглюкозы, глюкозо-б-фосфата,.НАД Н и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в течение 30-90 мин при 37 С. Общий объем пробы 75-100 мкл. К пробам добавляют

25-50 мкл 1 н.НС1, стероиды : 58-андростан-ЗЫ,17р-диол, 5 -андростан-34, 17 -диол, 5d -днгидротестостерон и лиофилизуют. К остатку добавляют 50100 мкл смеси бензолметанол (1:1) и хроматографируют пробы в системе растворителей бензол:ацетон: этиловый спирт (9:1:0,5). Пластинки высушивают, опрыскивают. проявляющей смесью: ледяная уксусная кислота — концентриФ рованная серная кислота — анисовый у альдегид — метанол (25:t:3:71), нагревают 5-7 мин до 100-110 С. Соответствующие нужным метаболитам зоны вырезают вместе с алюминиевой подложкой, помещают в сцинтилляционный флакон, заливают сцинтилляционной смесью, радиометрию идентифицированных 1миа зон ведут, помещая в сцинтилляцион- (ф ную жидкость слой силикагеля с алюми- >, ниевой подложкой. Сл

1. 13

Изобретение относится к химии и биохимии природных соединений и может быть использовано для количественного определения радиоактивных органических соединений, в частности стероиднь|х гормонов.

Целью изобретения является повышение точности и ускорения способа за счет получения сухого остатка ðàдиоактивных стероидов исходной смеси и радиометрии идентифицированных зон в присутствии слоя силикагеля и алюминиевой подложки.

Способ осуществляется следующим образом.

Получают гомогенат аденомы предстательной железы человека в

0,05 моль - л-" фосфатном буфере рН 7„4 (H J 5A-дигидротестостерон при концентрации 100 нмоль-л " .инкубируют с гомогенатом аденомы предстательной железы в присутствии D-глюкозы, глюкозо-б-фосфата, НАД- Н и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в течение 30

90 мин при 37 С. Общий объем пробы

75 — 100 мкл. К пробам добавляют 25—

50 мкл 1 í НС1, намеченые стероиды:

5 -андростан-3Ы, 17р-диол, 5d-андростан-Зр, 17р-диол, 5Ы-дигидротесто- стерон и лиофилизируют. К остатку добавляют 50-100 мкл смеси бензолметанол.(i:1 по объему) и для хроматографии используют точный объем полученного раствора (обычно 40-90 мкл) .

Пробы хроматографируют в системе растворителей бензол:ацетон:этиловый спирт (9: 1;0,5). Пластинки высушива- ют, опрыскивают проявляющей смесью: ледяная уксусная кислота — конц. серная кислота — анисовый альдегид-метанол (25:1:3:71), нагревают от 5 до

7 мин при 100-110 С, соответствующие нужным метаболитам зоны вырезают вместе с алюминиевой подложкой и слоем силикагеля, помещают в сцинтилляционные флаконы, заливают сцинтилляционной смесью и радиометрируют на спектрометре модели 8100 "ЛКБ" Швеция) или модели СЛ-30 (11Интертекник", Франция). Абсолютные количества радиоактивных метаболитов подсчитывают, учитывая коэффициент эффективности счетчика.

Пример 1. Вариант 1. На вырезанные пластинки со слоем силикагеля разной площади в пределах 0,53,0 см наносят одинаковое количество радиоактивных f< C) гептадекана или (Н) гептадекана. Такое же коли40

55 личество P Cj андростен-4-3,17.-диона или (Hj тестостерона и такое- же количество радиоактивных нуклидов вносят в сцинтилляционные флаконы. Половину пластинок опрыскивают проявляющей смесью и проявляют при нагревании. Все пластинки помещают в сцинтилляционные флаконы, во все флаконы заливают сцинтилляционную жидкость и радиометрируют. Показано, что использование проявляющей смеси для детектирования стероидов вызывает химическое гашение при радиометрии только (H) соединений.

Положительный эффект предложения.

Предложенный способ практически устраняет потери радиоактивных веществ при анализе, выход радиоактивных стероидов после хроматографии

1007, а по известному способу 75—

85Х.

15903 2 чество радиоактивных соединений вносят в пустые сцинтилляционные флаконы. Во все флаконы добавляют одинаковый объем сцинтилляционной смеси, инкубируют при нормальных условиях

3 5-4,0 ч и радиометрируют. Показано, что плошадь вырезаемой зоныпластинки со слоем силикагеля на алюминиевой подложке мало влияет на коли-..

10 чественное определение радионуклидов.

Вариант 2. На пластинки одинаковой площади (QKQJIo 2 cM2) и одинаковой толщины слоя силикагеля наносят увеличивающиеся количества (AC) про15 гестерона или 3 H) тестостерона и

3 проводят радиометрию, как в варианте

1 данного примера. Показано, что присутствие пластинок не влияет на ради,ометрию пропорционально увеличивающе20 гося количества радионуклидов, меченых Р Cj или (H).

Вариант 3. Разные количества смеси (>Hj тестостерона или f Hj 5с -дигидротестостерона вместе с нерадиоактивными (по 10 мкг — 15 мкм каждого) наносят на пластинку "Силуфол 1", хроматографируют в системе растворителей, как указано выше в общем случае. Положение стероидов (пятна или

З0 зоны) определяют в парах йода, пятна вырезают и радиометрируют как в варианте 1 данного примера. Показано, что после хроматографирования сохраняется пропорциональность в количестве опреЗ5 деляемых радионуклидов.

Пример 2. На пластинки одинаковой площади (около 2 см ) и одинаковой толщины йаносят одинаковое ко13159

Формула изобретения

Составитель Л. Артюшина

Редактор Г. Гербер Техред Л.Олийнык Корректор Т Колб

Заказ 2355/47 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г. Ужгород, ул. Проектная, 4

В предлагаемом способе в одной пробирке проводятся следующие операции: 1) инкубация водных гомогенатов с радиоактивным соединением; 2) лиофилизация водных растворов радиоактивных соединений; 3) растворение (не экстракция) лиофилизированных радиоактивных веществ в точном объеме органического растворителя; 4) нанесение на хроматографическую пластин- f0 ку точного объема раствора радиоактивных соединений, хроматография и идентификация радиоактивных соединений; 5) вырезание зон (пятен) и радиометрия. f5

В предлагаемом способе достигнуто повышение точности, так как вообще отсутствуют потери радиоактивных веществ. В известных методах всегда 20 имеют место потери радиоактивных соединений и их учет проводят, добавляя дополнительно радиоактивные вещества аналогичной структуры, содержание С, как указывалось выше. 25

Следовательно, предлагаемый способ не только повышает точность анализа

Оз 4 радиоактивных соединений, сокращает время анализа (включает 5 стадий вместо 7), но и имеет значительный экономический эффект: в сотни раз уменьшается количество (объем) органических растворителей, необходимых для анализа, и отпадает необходимость дополнительного применения радиоактивных веществ, меченых " C.

Способ количественного определения радиоактивных метаболитов стероидов путем инкубации ткани с радиоактивным предшественником, получения сухого остатка радиоактивных стероидов, растворения сухого остатка, хроматографирования и радиометрии, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, сухой остаток получают лиофилизацией исходной смеси, а радиометрию идентифицированных зон осуществляют, помещая в сцинтилляционную жидкость слой силикагеля с алюминиевой подложкой.