Штамм streptamyces coelicolor - продуцент ферментного комплекса 5-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы

 

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности. Целью изобретения является получение штамма актиномицета S.coelicolor ВКПМ S-756 (А-165-25), обладающего повышенной способностью к биосинтезу 5ʹ-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы и возможностью получения внеклеточных ферментов с более высоким уровнем активности. Предлагаемый штамм Strertomyces coelicolor ВКПМ S-756 (А-165-25) позволяет получить внеклеточные 5ʹ-экзонуклеазу и щелочную фосфатазу микробного происхождения, используемую для гидролиза нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) до нуклеозидов, применяемых в генной инженерии и в качестве химических реактивов. Штамм S.coelicolor А-165-25 получен в результате воздействия 4-бис-диазоацетилбутана (ДАБ) на молодые клетки (4-суточные) культуры, отобранной при рассеве штамма S.coelicolor А-18; концентрация мутагена 1%, время экспозиции 2 ч. Селекционную работу проводят на твердой питательной среде следующего состава, %: мука пшеничная, осахаренная α амилазой, 3; растворимый крахмал, осахараненный 2; сульфат аммония 0,6; кальций углекислый 0,6; калий хлористый 0,2; агар-агар 2. Окультивирование штамма S.coelicolor А-165-25 проводят на жидкой питательной среде того же состава, только без агара, в условиях качалки при 180 - 200 об/мин и при температуре 28 - 30^oС. Максимальное накопление ферментов наблюдают к 72 ч роста продуцента. Активность штамма S.coelicolor А-165-25 по сравнению с исходным штаммом S.coelicolor М-18 в два раза выше и составляет по нуклеазе 600 - 650 ед/мл, по фосфатазе - 10 - 15 мкМ/мл. 1 табл.

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано для получения ферментного комплекса 5' -экзонуклеазы и щелочной фосфатазы, хорошо гидролизующего нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК) до нуклеозидов, используемых в генной инженерии и в качестве химических реактивов. Целью изобретения является получение штамма, обладающего повышенной способностью к биосинтезу 5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы и возможностью получения внеклеточных ферментов с более высоким уровнем активности. Штамм Streptomyces coelicolor ВКПМ S-756 (А-165-25) получен в результате воздействия 4-бис-диазоацетилбутана (ДАБ) на молодые клетки (4-суточные) культуры, отобранной при рассеве штамма S. coelicolor А-18; концентрация мутагена 1% время экспозиции 2 ч. Селекционную работу проводят на твердой питательной среде следующего состава, мука пшеничная, осахаренная α-амилазой 3; растворимый крахмал осахаренный 2; сульфат аммония 0,6; кальций углекислый 0,6; калий хлористый 0,2; агар-агар 2. Культивирование штамма S. сoelicolor А-165-25 проводят на жидкой питательной среде того же состава, только без агара, в условиях качалки при 180-200 об/мин и температуре 28-30^оС. Максимальное накопление ферментов наблюдали к 72 ч роста продуцента. Показатель общей нуклеазной активности, определяемой спектрофотометрическим методом по изменению поглощения кислоторастворимых продуктов распада РНК (6 мг/мл), составляет 600-650 ед/мл фильтрата культуральной жидкости, по фосфатазе 10-15 мкМ/мл. Показатели исходного штамма: нуклеазная активность 200-250 мкМ/мл, фосфатазная активность 6-8 мкМ/мл. Морфология. Твердая среда, содержащая осахаренные α-амилазой пшеничную муку и растворимый крахмал, соли. При выращивании культуры на такой среде мицелий имеет вид очень тонких, разветвленных гиф, стенки клеток мицелия прямые, ширина варьирует от 0,71-0,93 мкм, споры не образуются. Культурально-физиологические признаки. При выращивании S. coelicolor А-165-25 на твердой питательной среде, содержащей осахаренные пшеничную муку и растворимый крахмал, соли, культура образует колонии круглой формы в виде тонкой морщинистой пленки кремоватого цвета, воздушный мицелий отсутствует. Диаметр гигантской колонии на десятые сутки роста 10-12 мм. Нижняя поверхность колонии гладкая, среда не буреет, пигмент в среду не выделяется, споры отсутствуют. На агаризованной среде Чапека, содержащей глюкозу, рост слабый, диаметр колонии 3-4 мм, поверхность колонии гладкая, матовая, в центре по окружности окрашена в ярко-розовый цвет, спор нет. На крахмал-аммиачной среде с минеральным фосфатом образуются колонии диаметром 7 мм, круглые, поверхность колонии бархатистая окрашена в серо-голубоватый цвет с ровной белой окаемкой, под пленкой субстрат окрашен в светло-зеленый цвет, образуется небольшое количество спор. На сусле-агаре рост культуры отсутствует. На картофельно-пептонном агаре рост хороший, колонии в виде морщинистой пленки, в центре колонии, слегка выступающей над поверхностью агара, края ровные, воздушный мицелий развит слабо, колонии окрашены в красновато-розовый цвет. На синтетической среде с азотнокислым аммонием культура растет слабо в виде небольших колоний диаметром 3-4 мм, колонии гладкие, элипсоидной формы, спор нет. На ломтике моркови и картофеля рост отсутствует, нитраты не восстанавливает. Отношение к углеводам: крахмал гидролизует, сахара потребляет с подкислением среды. Мясопептонную желатину не разжижает. Отношение к температуре: при 20^оС рост хороший сплошной пленкой желтого цвета; при 30^оС рост такой же; при 37^оС рост нормальный; при 50^оС рост культуры отсутствует. В таблице отражены сопоставительные лабораторные данные, характеризующие способность исходного штамма А-18 и мутантного штамма А-165-25 синтезировать ферментный комплекс 5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы в глубинных условиях. Фактические данные анализов. Культивирование обоих продуцентов проводят в одинаковых условиях на жидкой питательной среде следующего состава, пшеничная мука, осахаренная бактериальной α-амилазой, 3; растворимый крахмал, осахаренный бактериальной α-амилазой, 2; аммоний сульфат 0,6; кальций углекислый 0,6; калий хлористый 0,2; вода остальное. Данные, приведенные в таблице, показывают, что при одинаковых параметрах культивирования мутантный штамм отличается от исходного повышенной способностью синтезировать ферментный комплекс 5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы. П р и м е р. Для получения препарата штамма S. сoelicolor А-165-25 выращивают в глубинных условиях на среде, содержащей осахаренные α-амилазой пшеничную муку и растворимый крахмал, соли, при аэрации 1 объема воздуха на 1 объем среды в минуту в течение 48 ч. Активность 5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы составляет 600 ед/мл и 12 мкМ/мл соответственно. В фильтрат культуральной жидкости продуцента добавляют магний хлористый в качестве стабилизатора, охлаждают до 4^оС и ферментный комплекс осаждают 4,0 объемами этилового спирта. Полученный осадок сушат в вакуум-сушильном шкафу при комнатной температуре. Активность ферментного комплекса по нуклеазе составляет 59 ед/мл, по фосфатазе 2,0 мкМ/мл. Таким образом, штамм S.coelicolor А-165-25 позволяет получить внеклеточный комплекс 5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы, который хорошо гидролизует нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК) до нуклеозидов, используемых в генной инженерии и в качестве химических реактивов.

Формула изобретения

Штамм Streptomyces coelicolor-ВКПМ S-756 - продуцент ферментного комплекса 5'-экзонуклеазы и щелочной фосфатазы.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2002

Извещение опубликовано: 10.04.2002        

---