Штамм бактерий еsснеriснiа coli-продуцент липополисахарида, обладающего митогенной активностью

 

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма, который может быть использован в микробиологической промьшшенности для производства реактивов при проведении иммунологических реакций. Цель изобретения - штамм бактерий, способней продуцировать, липополисахарид, являющийся митогенным фактором в иммунологической реакции бласттранс-. формации лимфоцитов. Штамм Е. coli 137, обладающий этими свойствами, выделен из кишечника здорового человека . а S (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 12 Р 19/04//(С 12 Р 19/04

С 12 R 1:19) 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

I j-"

1 (21) 4068153/31-13 (22) 15.05.86 (46) 15.01.88. Бюл, У 2 (71) Институт микробиологии и вирусологии им, Д, К. Заболотного, Всесоюзный научно-исследовательский институт гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс и Киевский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (72) И, Я, Захарова, С, И. Скрипник, Т. Г. Омельянец, Е. А. Федоровская, А, П. Рыбальская и 3. M. Андреева (53) 663.15(088.8) (56) Патент США N - 3976544, кл. 195-2, 1976.

Патент США Р 4042678, кл. 424-12, 1977.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ÄÄSUÄÄ 1366528 А 1 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA СО ? — ПРОДУЦЕНТ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО МИТОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма, который может быть использован в микробиологической промьппленности для производства реактивов при проведении иммунологических реакций. Цель изобретения — штамм бактерий, способный продуцировать липополисахарид, являющийся митогенным фактором в иммунологической реакции бласттрансформации лимфоцитов. Штамм Е. coli

137, обладающий этими свойствами, выделен из кишечника здорового человека. при введении через рот 5,55 10" <

+1,93 10" микр.кл./животное; при интраназальном введении ЛД для мыso шей не определяется — максимально возможная для введения доза 5 0 ° х10 микр.кл./животное вызывает гибель лишь 1 из 1.0 зараженных животных, Морфологических изменений в органах и тканях зараженных животных не выявлено.

Штамм Е. coli 137 не патогенен для теплокровных организмов.

Выращивание микробной массы штам" ма Е. coli 13? и получение липополисахарида производят следующим образом.

Для получения инокулята используют 24-часовую культуру, выращенную на мясо-пептонном агаре при 37 С в колбах объемом 500 мл со 100 мл жидкой синтетической среды следующего состава, Х: пептон 1,5, глюкоза 1,0, дрожжевой экстракт 0,5, Na HPO 2Н О

0,8, NaC1 0,3, М@ЯО+ 7Н 0 0,02, Полученным посевным материалом засевают ферментеры со средой аналогичного состава в объеме 2Х от количества засеваемой среды. При этом ферментер на 50Х объема заполняется средой. Выращивание осуществляют при

37 С в течение 18 ч. В конце инку" бации бактериальные клетки определяют центрифугированием при 5500 об/мин, Промывают 3 раза ацетоном при цент" рифугиро вании (10 мин, 2500 об/мин) и высушивают на воздухе, Липополисахарид получают по методу Вестфаля.

П р. и м е р. Штамм Е. cali 137, хранящийся в столбике мясо-пептонного агара (МПА) под маслом, высевают на косяк с МАА и .выращивают в термостате при 37 С в течение 24 ч. Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой указанного составаа и засевают в колбы емко стью 500 мл, содержащие 100 мл аналогичной питательной среды, Выращивают 24 ч при

37 С, после чего инокулят в объеме

2Х от объема среды в ферментере засевали в ферментер АНКУМ-2 емкостью

3 л, заполненный на 50Х (1,5 л) средой того же состава. Ин генсивность аэрации в ферментере — 1,5 л/л.мин . при 100 об/мин мешалки, длительность выращивания бактерий 18 ч при 37 С.

Культуральную жидкость затем центрифугируют при 5500 об/мин в течение

30 мин. Биомассу промывают 3 раза

1 1366528

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма, который может быть использован в микробиологической промышленности для

5 производства реактивов при проведе" нии иммунологических реакций, Цель изобретения — штамм бактерий, способный продуцировать липополисахарид, являющийся митогенным фактором в иммунологической реакции бласттрансформации лимфоцитов.

Штамм Е. coli ИМВ-2417, обладающий этими свойствами, выделен из ки- . шечника здорового человека общепринятым методом с помощью элективной питательной среды Эндо и отобран в результате селекции из многих штаммов Е. coli по признаку наибольшей митогенной активности.

Депонирован в коллекции Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических пре" паратов им. Л, А. Тарасевича МЗ СССР и имеет регистрационный номер 137. 25

Штамм имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки.

Морфологические признаки. Клетки — мелкие палочки 1,1-1,5 х 2,0- 30

6,0 ммк. Спор не образуют, грамотрицательные, подвижные, перитрихи.

Культуральные признаки. Хорошо растет на обычных питательных сре" дах. На.мясо-пептонном агаре колонии круг3тые, гладкие, с блестящей поверхностью. На мясо-пептонном бульоне дает обильный рост, образуя помутнение и осадок. Растет в аэробных условиях при 30-37 С, рН 6,5-8,0.

Биохимические признаки ° Разлагает с образованием кислоты галактозу, клюкозу, арабиноэу, мальтозу, маннит, сорбит, не ферментирует сахарозу. В качестве единственного источника уг- 45 лерода может использовать ацетат.

Нитраты восстанавливает до нитритов, образует индол.

Штамм Е. coli 137 при культивировании на синтетической среде, содержащей ферментолизат кукурузной муки, продуцирует липополисахарид, обладающий митогенной активностью.

Безвредность. Штамм относится к невирулентным для теплокровных организмов культурам. ЛД этого штамма

5о для белых мышей составляет: при внутрибрюшинном введении 1,52 10" 0,57х

«10" микробных клеток. на животное;

13665

Ф о р м у л а изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli

ГИСК N- 137 — продуцент липополиса-а харида, обладающего митогенной ак" тивностью.

Составитель Л. Минеева

Редактор M. Недолуженко Техред Л. Сердюкова Корректор А, Тяско

Заказ 6772/23 Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r Ужгород, ул, Проектная, 4 ацетоном при центрифугировании (10 мин, 2500 об/мин) и высушивают на воздухе.

Извлечение липополисахарида про"

5 водят по методу Вестфаля. 10 r cyхих бактериальных клеток экстрагируют 300 мл фенолводной смесью при

65 С в течение 20 мин при интенсивном перемешивании. Смесь охлаждают до

10 С и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 50 минут. Водный слой сливают в отдельный сосуд, а к фенольному слою и нерастворимому осадку добавляют один объем воды и обрабатывают повторно. Объединенные экстракты диализуют против проточной, а затем дистиллированной воды до полного удаления фенола и лиофилизируют.

Липополисахарид используют в ка- 20 честве митогена в реакции бластной трансформации лимфоцитов периферической крови с помощью микрометода

П. Г. Нараэова и В, И. Пуриня.

Культуральная среда общим объемом 2б

3 мл содержит 0,3 мл цельной крови„

0,3 мл сыворотки IV группы (предварительно проинактивированной при

56 С в течение 30 мин), 100 мкг/мл липополисахарида и среду 199, Пробы культивируют в течение 5 сут, Учет реакции бласттрансформации лимфоцитов проводят морфологическим методом в фиксированных и окрашенных по

28

Романовскому-Гимза мазках. В каждом препарате анализируют 200 клеток.

В качестве бластных учитывают переходные формы — крупные клетки со средним диаметром 14 нм, увеличенным ядром, базофильной цитоплазмой, собственные бласты — крупные клетки неправильной формы диаметром 2024 нм, с эксцентричным ядром, вакуолизированной цитоплаэмой, клетки в стадии митоза. Помимо процентного выражения результатов реакции бласттрансформации лимфоцитов вычисляют индексы стимуляции (отношение коли" чества бластов в опыте к количеству бластов в контроле), При этом индекс стимуляции лимфоцитов составляет

3,7+ 0,3 имп/мин, процент бластных форм 20, 8+1, 9, что указывает на способность липополисахарида вызывать бласттрансформацию лимфоцитов.

Таким образом, предлагаемый штамм

Е. cola 137 является новым штаммом, продуцирующим липополисахарид с митогенной активностью.