Штамм бактерии еsснеriснiа coli вкпм в-3420 - продуцент l- треонина

 

Изобретение относится к микрс;- биологической проьышлешюсти и касается НОВОГО штамма бактерий 5 продуцирующего аминокислоту L-треонин, которая может применяться в различных отраслях народного хозяйства. Новый штаммпродуцент Ij-треонина Escherichia coli ВКПМ В-3420 (ВНИИгенетика-ТДГ-6) имеет гибридную ппазмиду, содержасцую ге ны треонинового оперона, блокирующие биохимическую деградацию L-треонина. Использование нового прод; а1,ента позволяет повысить уровень на.коале1шя L-треонина в ферментационной среде до 85 г/л, а также С1шзить удельный расход углеводного сырья на 15-22% по сравнению с лучшими изБест а1№1 штаммa a ;-пpoдyцeнтaми L-треонина. 2 табл. up Новый штамм бактерий PJscherichia coli ВКПМ способен накагьчивать до 85 г/л треонина за 54 ч ферментации . При этом удельный расход Сахаров составляет 2 г/л. Новый штамм получен на основе штамма Е. coli ВШШгенетика 472 Т-23 и, сохраняя его генетические особенности , отличается от него неспособностью - к ферментативной деградации треонина , первый этап которой катализируется треониндегидрогеназой. Штамм Е, coli ВКПМ В-3420 получен путем передачи в исходный штамм Е. coli ВНИИгенетики 472 Т-23, инактивиронанного транспозоном Тп5, гена, кодирующего треониндегидрогеназу, методом s:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 } 4064356/28-13 (22) 31,01,86 (46) 23.08.90. Бюл. № 31 (71 ) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72 ) 11,М, Гусятинер, Н,И, Жданова, И.О.Шакалис, Т,А,Бачина, А, К, Соколов, А. В. Бел арена, IО,И. Козлов, Е,М. Хургес и В. Г,Дебабов (53) 663 ° 15 (088.8) (56 ) Патент США № 4347318, кл, 435-1 15, 19 82, Авторское свидетельство СССР № 974817, кл, С 12 Р 13/08, 1981, (54 ) UlTAMM БАКТЕРИИ EKIIMICkilA COLS

BKIIN В-3420 — ПРОДУЦЕНТ Ь-ТРЕОНИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, продуцирующего аминокислоту L-треонин, которая может применяться как компонент различных питательных смесей медицинского назначения „в качестне добавки н корм животных > как реактив фармацевтической и химической промышленности и как ростовой фактор дня микроорганизмов, продуцируюших другие аминокислоты, например Ь-лизин -и Ь- гомосерин.

Целью изобретения является изыскание нового штамма бактерий, обладающего высокой биосинтетической активностью по отношению к L-треонину (51)5 С 12 Р. 13/08, С 17 Б 1/20// .{С 12 И 1/20, С 12 H 1:19}

2 (57 ) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается ноного штамма бактерий, продуцирующего аминокислоту L-треонин, которая может применяться в различных отраслях народного хозяйства, Новый штаммпродуцент L-треонина Zscherichia coli

HKIIM В-3420 (ВНИИгенетика-ТДГ-6) имеет гибридную пл аз миду, содержащую гены треониново го оперона, блокирующие биохимическую деградацию Ь-треонина, Использование нового продуцента позволяет повысить уровень накопления

L-треонина в ферментационной среде до

85 г/л, а также снизить удельный расход угленодного сырья íà 15-22% по

C) сравнению с лучшими известными штаммами-продуцентами L-треонина, 2 табл.

Новый штамм бактерий Escherichia

coli BKIIH В-3420 способен накапливать до 85 г/л треонина за 54 ч ферментации, При этом удельный расход сахаров сост анляет 2 г/л, Новый штамм получен на основе штамма Е, coli ВНИИгенетика 472 Т-23 и, сохраняя его генетические особенности, - отличается от него неспособностью к ферментативной деградации треонина, первый этап которой катализирует. ся треониндегидрогеназой.

Штамм Е, cali ВКПМ В-3420 получен путем передачи в исходный штамм Е, coli ВНИИгенетики 472 Т-23, инактивирон àííî ro тр анспоз оном Тп5, гена, кодирующего треониндегидрогеназу, методом

1362021 общей трансдукции бактериофагом Р I, выращенным на клетках мутанного штамма Е. coli И50, дефектного по трео- ни нде гидро геназ е. 5

Транспозон Тп5 сообщает клеткам устойчивость к манамщину.

Таким обр аз ом, новый штамм в отличие от всех других продуцентов треонина, созданных на основе Е, coli, 10 не способен к превращению синтезированного им или добавленного в среду треонипа в продукты деградации (аминоацетон, глицин, ацетил-КоА), что способствует повышению. уровня накоппе. I5 ния треонкна в культуральной жидкости и снижает расход углероцного сырья, Штамм Е. co li. ВКПБ-3420 (ВНИИгенетика ТДГ-6) имеет слецующие культурально-морфологические и физиолого- 20 биохимические признаки.

11орфолого-культуральные признаки.

Грамотрицательные, слаб опоцвижные па1 лочки с закругленнымк концами размером 1,5-2 мкм в длину. 25 На мясо-пептонном агаре через 24 ч роста при 37 С образует кру лые, беловатые, полупрозр ачные колонии диаметpQM 1;5-3 мм, глацкая, края ровные или слегка вал- 30 нистые, центр колонии пркпоцнят, структура однороцная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется, На агаризованной минимальной среде

Адамса через 40-48 ч роста при 37 С образует колонии 0,5-1,5 мкм н диаметре, серовато-белые, полупрозрачные, слегка выпуклые, с блестящей поверхно стью, На мясо-пептонном бульоне удельная 40 скорость роста при 37 С 1,2-1,3 ч

После 24 ч роста — сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, запах характерный, На жидкой ьппп мальной среде Адам 45 о са удельная скорость роста при 37 С

0,1 0 2 ч 1. Через 2 сут роста с аэрацией — сильное равномерное помутнение, запах характерный, 50

По уколу в мясо-пептонном агаре хороший рост по всему уколу, Физиолого-биохимические признаки, Желатину не разжижает. Хороший рост с коагуляцией молока ° Инцол образует.

Хорошо растет на сахарозе, глюкозе, 55 лактоэе, маннозе, галактозе, ксилоэе, фруктоз е, глицерине, ма оп те с

1 образованием кислоты и газа, Устойчив к пенициллину и к намицину е

Клетки содержат многокопийную плазмиду pYN7 (мол,мас. 5,8 мегадальтон), обеспечивающую устойчивость к пенициллину и несущую гены треонинового оперона.

Устойчив к L-треонину и L-гемосериHjj °

При росте в присутствии L-треонина аминоацетон не образует, Получение L-треонина с использованием нового штамма-продуцента осуществляется следующим образом, Клетки штамма-продуцента Е. coli выращивают на агаризов анной среде

Адамса в присутствии пенициллина, затем суспензией клеток, смытых со скошенного агара, засевают жидкую питател-ьную срецу, содержащую источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, питательную добавку в виде гидролизата бепоксодержаших субстратов и пенициллин. Посевной материал выращивают в ферментере, оснащенном системой рН-статирования, при рН 6,87,2, температуре 36-38 С и непрерывном аэрировапии . перемешивании в тЕчение 20-24 ч, При готовленный посевной материал в объеме 10- I5% используют для засева ферментационной среды, содержащей источник углерода, например сахар или мелассу, источник азота и необхо,цимые минеральные соли, Фермент ацию осуществляют в фер ментер ах, оснащенных системой рН-статированкя, при рН 6,8-7,2, температуре 36-38 С и непрерывном аэрировании и перемешивании. В качестве рЧ-статкрующего агента применяют аммиачную воду или сб ал ан сир о в анную по угл ер оду и аз оту аммиачно-углеводную подпитку, Процолжитепьность ферментации 40-60 ч, К концу культивирования в культуральной жидкости накапливается до 85 г/л треанкна, удельный расход источника углерода на синтез 1 г треонина составляет 2 г, Накопление а иноацетона в культурапьной жидкости отсутствует, Пример 1, Культуры Е, coli

ВНИИгенетика 472 Т-23 и штамма Е. coli

ВКПМ В-3420 параллельно выращивают на агаризованной среде Адамса, содержащей сахар озу (О, 2X) и пенициллин (500 ед/мл) и засеивают имк жидкостную посевную срецу следующего состаЕ:! 362021

2,0

0,3 живается в пределах 6,8-7,2 путем автоматической подачи по сигналу от датчика рН сахароаммиачной подпитки, приготовление которой указано выше.

Ферментацию проводят в течение 48 ч.

Показатели процесса биосинтез а трео" нина через 48 ч ферментации приведены в табл, 1, Пример 2. Выращивание штаммов на посевной и, ферментационной средах ведут в условиях, аналогичных примеру 1. Отли же состоит в том, что в ферментационную среду добавлен

15 дрожжевой экстракт в количестве О,!X.

Ферментация продолжается 54 ч. Показатели процесса биосинтеза треонина в эти условия приведены в табл. 2.

Сахароэ а

Аммоний сернокислый

Аммоний фосфорнокислый двузамещенный

Магний сернокислый

7-водный

Калий хлористый

Железо (I I) сернокислое 7 водное

Марганец (II) сернокислый 5-водный

Дрожжевой экстракт

Бе нзил пенициллин ат натрия

Вода

0,08

0,04

0,04

0,002

0,002

0,2

200 ед/мл

Остальное

По с ев ной мат ери ал выр ащи в ают в фермент ер ах емкостью О, 5 л при аэрировании 0,5 л воздуха в 1 мин и пе- 20 + о P м У л ремешинании со.скоростью 900 об/мин при 37 С. Значение рН поддерживается в пределах 6,8-7,2 путем автоматической подачи по сигналу от датчика рН сахаро-аммиачной подпитки, которая готовится смешиванием 6,5 объемов стерильного 40%-ного раствора сахаро- Штамм зы с одним объемом 14,7 н ° аммиачной воды. Чер е з 20 ч кул ьтиниро в ания

50 мл культуры вносят и ферментацион- 30 ную среду следующего состава, Е:

С ахароз а 3,0

Аммоний серно кислый 0,5 472 Т-23

Аммоний фосфорнокислый двуз амещенный

ТДГ-6

Калий хлористый 0,06

Натрий хлористый 0,06

Магний сернокислый

7-водный 0,04

Железо (ХХ) сернокислое 7-водное О, 002

Мар ганец (I Х) сер нокислый 5-aoamrA 0,002

Вода Остальное

Ферментация осуществляется в фер- g5 ментерах емкостью 0,5 л при аэрировании 0 5 л воздуха в 1 мин и перемеши- 472 нанни со скоростью 900 об/мин при ТДГ-6 о температуре 37 С. Значение рН поддер1

60 иэ обр етения

Штамм бактерии Escherichia cali

ВКПМ В-3420 — продуцент L-vp o va,.

Т аблица

Потребление саНакопление харозы в расче, те на 1 г синтези. ров анно го треонина, г/ г треонина, г/л

2,38

57,0

2,01

75;9

Т аблица2

Штамм

На::опПотребление Сахарозы в расчете на 1 г синление треонина, г/л тезированного треоыша, r/г

2,55

1,99

85,0

Составитель В, Варл амон

Техред N. Моргентал

Корректор О,Ципле

Редактор Л. Бельская

Тир аж 486

Подписное

Заказ 3087

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101