Способ получения стабильного водорастворимого гемин- аргинатного или гемин-лизатного комплексного соединения для лечения порфирии

 

Изобретение относится к медицине , а именно к способам получения физиологически активных веществ, предназначенных для применения в таблетк ах, капсулах или для инъекций при лечении некоторых видов железодефицитных анемий и порфирии. Цель изобретения - получение более стабильного препарата. Для этого осуществляют реакцию слабо растворимого в воде кристаллического гемина с подходящим основанием, например аминокислотой , такой как L-лизин или L-ap- гинин. Молекула гемина несет две карбоксильные группы, взаимодействующие с основными аминогруппами L-лизина или L-аргинина. Гемин-аргинат или гемин-лизинат растворяют в воде. Осуществляют реакцию кристаллического гемина с L-ЛИЗИНОМ или L-аргинином в молярном отношении 1:2 и 1:3 при интенсивном перемешивании в смеси растворителей , включающей органический растворитель (ацетон) и воду в соотношении 300:10-300:20 при 20 С в течение 10-15 ч. Полученный им препарат безопасен и эффективен при лечении острой гепатитной порфирии. 2 табл. I СО

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) 4188 АЗ (5D 4 A 61 К 35/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /

-=

H ПАТЕНТУ (21) 3831925/28-14 (22) 09.01.85 (46) 23.03.88. Бюл. 1Ф 11 (71) Медика Фармасьютикал Компани, Лтд (Р?) (72) Грелс Даниель Инберг, Ритва Лайла Анери Пенттиля, Рейно Олави Токола и Раймо Антеро Тенхунен (FI) (53) 615.45(088,8) (56) Патент ФРГ Ж 2656157, кл. С 07 <; 7/00, 1977. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНОГО

ВОДОРАСТВОРИМОГО ГЕМИН-АРГИНАТНОГО

HJIll lENHH-ЛИЗАТНОГО КОМШ1ЕКСНОГО

СОЕДИНЕНИЯ Д1И ЛЕЧЕНИЯ ПОРФИРИИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения физиологически активных веществ, предназначенных для применения в таблетках, капсулах или для инъекций при лечении некоторых видов железодефицитных анемий и порфирии. Цель изобретения — получение более стабильного препарата. Для этого осуществляют реакцию слабо растворимого в воде кристаллического гемина с подходящим основанием, например аминокислотой, такой как l.-лизин ипи L-аргинин. Молекула гемина несет две карбоксильные группы, взаимодействующие с основными аминогруппами L-лизина или L-аргинина. Гемин-аргинат или гемин-лизинат растворяют в воде. Осуществляют реакцию кристаллического гемина с L-лизином или 1.-аргинином в молярном отношении 1:2 и 1:3 при интенсивном перемешивании в смеси растворителей, включающей органический растворитель (ацетон) и воду в соотношении 300: 10-300:20 при 20 С в течение 10-15 ч. Полученный им препарат безопасен и эффективен при лечении острой гепатитной порфирии.

2 табл.

1384188

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения физиологически активных веществ, предназначенных для применения в таблетках, капсулах или для .инъекций при лечении порфирии и некоторых видов железодефицитных анемий.

Цель изобретения — получение более стабильного препарата. 10

Способ осуществляют следующим образом.

Осуществляют реакцию слабо растворимого в воде кристаллического гемина с подходящим основанием, например ами-15 нокислотой, такой как Ь-лизин или Lаргинин в смеси растворителей, содержащей воду и ацетон. Состав растворителя, а именно отношение органического растворителя к воде, важен с точ- 20 ки зрения медицинской ценности целевого продукта. Содержание воды в смеси растворителей столь мало (около

7X), что ни гемин, ни достаточно легко растворимый L-аргинин не раство- 25 ряются. Реакция имеет место при интенсивном.перемешивании и определенном рН раствора. Полученный продукт выделяют и высушивают. Таким образом, соединение гемина получают в сухом 30 виде и оно растворимо в воде, что существенно как с медицинской, так и с фармакологической точки зрения.

Молекула гемина несет две карбоксильные группы, которые взаимодейст- 35 вуют с основными аминогруппами L-лизина или L-аргинина.

Гемин-аргинат и гемин-лизинат, полученные по предлагаемому способу, растворяют в воде и через определен- 40 ные промежутки времени измеряют рН растворов и сравнивают эти значения с рН механической смеси гемина и

L-аргинина, растворенных в воде.

Результаты исследований представ- 45 лены в табл. 1, Из табл. 1 следует, что рН геминаргината и гемин-лизината стабильны (рН около 8) в течение 24 ч. С другой стороны, рН механической смеси очень медленно уменьшается, вероятно в результате очень медленной реакции между карбоксильными группами гемина и аминогруппой L-аминокислоты. Поэтому таким способом невозможно получить продукт, имеющий терапевтическую ценность. Гемин-аргинат и гемин-лизинат, полученные по предлагаемому способу, представляют собой комплексное соединение, полученное в результате реакции L-аминокислоты с карбоксильными группами гемина.

Для определения, с одной стороны, оптимального молярного отношения двух реагентов и, с другой стороны, наиболее подходящего состава смеси растворителей с гемином и аргинитом, проводят следующие тесты.

Осуществляют реакцию кристаллического гемина с L-лизином или L-аргинином в молярном отношении 1:2 и 1:3 при интенсивном перемешивании в смеси растворителей, включающей органический растворитель и воду в различных отношениях. Выпавшее в осадок вещество фильтруют, промывают и сушат.

Растворимость вещества в воде определяют путем растворения 1,0 г геминаргината, полученного в каждом тесте, в 50 мл дистиллированной воды, при интенсивном перемешивании в течение 1 ч.

Растворы центрифугируют (3500 об/

/мин), остаток промывают 10 мл дистиллированной воды и 10 мл ацетона, высушивают и взвешивают, Нерастворимый остаток в основном представляет собой непрореагировавший гемин.

Результаты тестов представлены в табл. 2.

Образовавшееся в некоторых тестах смолистое вещество можно перевести в порошковую форму. При этом установлено, что желательно иметь отношение гемина к аргинину или лизину

1:3, а предпочтительный растворитель должен включать 300 мл ацетона и

20 мл воды, так как для того, чтобы реакция между гемином и L-аргинином или L-лизином произошла соответствующим образом, необходим большой избыток L-аргинина или L-лизина.

Пример 1. 6,26 r кристаллического гемина (0,01 M) и 3,48 г кристаллического L-аргинина (0,02 M) в лабораторном стакане, снабженном механической мешалкой и содержащем смесь растворителей из 300 мл ацетона и 20 мл воды, интенсивно перемешивают в течение 10 ч. Полученный продукт фильтруют, промывают ацетоном и сушат. Выход гемарин-аргината

9,5 r (95X) . Количество нерастворимого остатка определяют по описанному способу и получают 0,14 г (14X).

Пример 2, 6,52 r кристаллического гемина (0,01 М) и 4,38 r

1384188 кристаллического L-аргинина (0,025 M) обрабатывают по примеру i, а перемешивание производят в течение 12 ч.

Выход гемин-аргината 11,1 г (1007),, нерастворимый осадок 0,042 r (4,2Х).

Пример 3. 6,52 r кристаллического гемина (0,01 M) и 5,23 кристаллического .-аргинина (0,03 M) обрабатывают по примеру i, а перемешивание проводят в течение 13 ч.

Выход гемин-аргината 12,0 r (95Х), нерастворимый остаток 0 0005 r (0,05X).

Пример 4. 6,52 r кристаллического гемина (0,01 M) и 4,39 r кристаллического Ь-лимина (0,03 M) обрабатывают по примеру 1, а перемешивание проводят в течение 13 ч.

Выход гемин-лизината 10,8 г (99X), 20 нерастворимый остаток 0,020 г (2,8X).

Пример 5. 6,52 г криссталлического гемина (0,01 M) и 6,1 кристаллического Е-аргинина (0,035 М) обрабатывают по примеру 1. 25

Выход гемин-аргината 12,0 r (95X), нерастворимый остаток 0,0005 r (0,05/).

Пример 6. У самцов крыс СпрагДоулей (180-250 г) вызывают порфирию подкожным введением 300 мг/кг 2-аллил-2-изопропилацетамида (AIA) в течение 3 дн. Другую группу крыс обрабатывают АТА и гемин-L-аргинатным комплексом, полученным по примеру 3, 10 мг/кг интраперитонеально в течение 3 дн.

У обработанных AIA крыс дневная экстрекция мочевого порфобилиногена (РВС) повьппается от средней величины

0,08 ммоль (интервал 0,05-0,13) до

6, 79 ммоль (интервал 9, 91-12, 70), .а дневная экскреция мочевой дельта-ами" нолевулиновой кислоты (АЬА) от 0,20 ммоль (0,15-0,23) до 7,77 ммоль (2,49-11,50). С другой стороны, у крыс, обработанных А?А и веществом, полученным по примеру 3, повышение экскреции в моче PBC (до 0,28; интер. вал 0,09-0,45 ммоль/день) и ALA (до

0,51, интервал 0,23-0,83 ммоль/день) меньше.

Синтезная активность дельта-аминолевулиновой кислоты (ALA) в эритроцитах (3,96; интервал 2,23-6,06 ммоль

ALA/÷/10 ðåòèêóëîöèòaâ) и в печени (15,4; интервал 12,5-. 17, 1 ммоль) (А1.А) мг белка/ч) у AIA обработанных крыс вьпне, чем соответствующие величины (1,42; 1,72 ммоль

ALA/÷/10 ретикулоцитов и 11,5; интер1 вал 9,8-13,7 ммоль А? А/мг белка/ч) у крыс, обработанных AIA и материалом, полученным по примеру 3, Активность гем-оксигеназы (НО) снижается в большей степени у. AIA обработанных крыс до неизмеримого уровня, тогда как у крыс, обработанных AIA и материалом, полученным по примеру 3, НО активность составляет

16,2 ммоль/мин/мг белка (интервал

9,3-29,3).

Порфириногенное действие AIA обра" ботки может быть также предотвращено внутримьнпечным введением гемин-L-аргинатного комплекса, полученного согласно примеру 3, s дозе 10 мг/кг.

Однократное внутривенное введение (20 мг/кг) вызывает такой же антипсрфириногенный эффект.

Исследования показали, что этот препарат является эффективным, как и гематин.

Пример 7. Биохимическое действие стабильного и легко растворимого гем-производного, полученного по примеру 4, изучено на десяти пациентах с острой Иепатитной порфирией в бессимптомной фазе болезни. Шесть .пациентов с острой перемежающейся порфирией (AIP) получали 2 мг (два) или 3 мг/кг/день (четыре) в периферическую вену в течение 4 дн. Вс время лечения средняя мочевая экскрекция порфобилиногена падала от

194 ммоль (интервал 60-465) до

17,2 ммоль (24 ч/7„1-30), а дельтааминолевулиновой кислоты от

133 ммоль (интервал 47-281) до

13,8 ммоль (24 ч/8,1-23,4). У четы-. рех пациентов с перемежающейся перфирией 3 мг/кг/день гем-производного в течение 4 дн снижался средний фекальный протопорфины от 650 ммоль/г (интервал 193-1140) до 89 ммоль/г/

/день сухого веса (62-103) и копропорфирии от 232 ммоль/г (интервал

102-360) до 23 ммоль/г сухого веса (8,5-40).

У двух пациентов с Л?Р три курса гем (3 или 4 мг/кг/день в течение трех или четырех дней) проведены во время острого приступа. У 21-летней женщины абдоминальные симптомы исчезли во время второго дня лечения в двух случаях. У 43-летнего мужчины с абдоминальной болью и периферической невропатией боль исчезла, а нев1384188 формулаизобретения ропатия стала улучшаться после последней из четырех посЛедовательных инфузий.

Тромбофлебит возник у девяти порфирических пациентов во время 51 инфузии. Не найдено других побочных эффектов или аномальностей в химии крови, включая изучение коагуляции.

Таким образом, предлагаемый гемпрепарат является безопасным и эффективным при лечении острой гепатитной порфирии.

Способ получения стабильного водорастворимого гемин-аргинатного или гемин-лизатного комплексного соединения для лечения порфирии путем перемешивания гемина с L-аргинином или

L-лизином в соотношении 1:2-1:3 5 и со смесью растворителей, состоящей из ацетона и воды в соотношении

300:10-300:20 при 20 С н течении

10-15 ч.

1О

Таблица 1

Раствор

Содержание, мл

0 мин 60 мин 24 ч

Гемин-аргинат 0,02937/25

Гемин-лизинат 0.,02760/25

8,22 8,22 8,22

8 10 7 97 8 13

0 0160/25+

0,01307/25

Гемин+?.-аргинин

10, 13 9,81 9, 33

Таблйца2

Содержание, r

Молярное Растворитель отношеГемин L-аргинин или Е-лио зин ние

Смолистое вещество

Метанол

300 20

300 40

" 100

1:2

Зтанол

20,2

1:3

6,52 3,48

100

Изопропанол 300 20

6 52 3,48

Изопропанол/

/вода

300:20 20

21,2

300:20

9,7

1:3

Ацетон/вода

300:15 20

1:2

12, 4

ЗОО:20 20

300:10 20

1:2

Ацетон/воды

100

6,52 3,48

1 О;54

6,52 3,48

6,52 5,22

6,52 5,22

6,52 3,48

6,52 3,48

6,52 5,22

Концентрация в течение

t (Содер Темпера Нерастворенный

Ю . жание, тура, С в воде остаток,7 мл

1384188

Продолжение табл. 2

Молярное Растворитель отношеt

Содержание, г

Нерастворенный в воде остаток,Х

Содер Темпера е жанне, тура, С

Гемин Ь-аргинин или ? -линие зин

300:10 40

300: 15 20

300:20 20

300:30 20

11,4

6,52 5,22

1:3

6,52 5,22

1:3

8,3

1:3

0,3

6,52

5,22

1:3

6,52 5,22

Смолистое вещество

6,52 5,22

6,52 5,22

4,2

150: 10 20

1:3

1:3

150:

: 12,5 20

Смолистое вещество

Составитель Л.Шилина

Редактор А.Козориз Техред И.Дидык Корректор О.Кундрик

Заказ 1354/57 . .Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4