Способ определения термостабильного @ -экзотоксина bacillus тнuringiеnsis

 

Изобретение относится к микробиологии и биохимии, точнее к способам получения и очистки биологически активных веществ из микробиологического и другого вида сьфья. Цель изобретения - повьшение точности и ускорение способа. Для этого культуральную жидкость, содержащую -экзотоксин , пропускают через диализную мембрану с последующим электрофорезом в потоке буфера, содержащего 0,01-0,015 М фосфат, рН 7,0-8,0, при плотности тока 0,1-0,12 А/см, времени разделения 150-200 с и скорости подачи фильтрата 0,02-0,05 см/с. После пропускания культуральной жидкости через диализную мембрану с помощью ультрафильтрационной ячейки, -экзотоксин освобождается от клеток и высокомолекулярных компонентов свыше 1000 дальтон. Фильтрат далее разделяют в электрофоретической камере , выделяя пик, содержащий чистый .р-экзотоксин. S (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

1042 А1 (19) (11) (51) 4 С 12 1 02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ ((21) 3968982/28-14 (22) 18.10.85 (46) 07.06.88. Бюл. Ф 21 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) А,В. Гаврюшкин и. В.М. Крамаров (53) 612.015(088.8) (56) Biochem J., 1969, v. 144, р. 477. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО ф -ЭКЗОТОКСИНА

ВАСПДЛЯ THURINGIENSIS (57) Изобретение относится к микробиологии и биохимии, точнее к способам получения и очистки биологичес.ки активных веществ из микробиологического и другого вида сырья, Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа. Для этого культуральную жидкость, содержащую Р -экзотоксин, пропускают через диализную мембрану с последующим электрофорезом в потоке буфера, содержащего

0,01-0,015 M фосфат, рН 7,0-8,0, при плотности тока О, 1-0, 12 А/см, времени разделения 150-200 с и скорости подачи фильтрата 0,02-0,05 см/с.

После пропускания культуральной жидкости через диализную мембрану с помощью ультрафильтрационной ячейки, Р-экзотоксин освобождается от клеток и высокомолекулярных компонентов свыше 1000 дальтон. Фильтрат далее

С> разделяют в электрофоретической камере, выделяя пик, содержащий чистый ,Р-экзотоксин.

1401042

Изобретение относится к области микробиологии и биохимии, в частности к способам получения и очистки биологически активных веществ из

5 микробиологического и другого вида сырья.

Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа, Культуральную жидкость, содержащую -экзотоксин, пропускают через диализную мембрану с последующим электрофорезом в потоке буфера, содержащего 0,01-0,015 М фосфат, рН 7,0-8„0, при плотности тока 0,10,12 А/см, времени разделения 150200 с и скорости подачи фильтрата

0,02-0,05 см/с. При этом после про- пускания культуральной жидкости через диализную мембрану с помощью 20 ультрафильтрационной ячейки -экзо токсин освобождается от клеток и высокомолекулярных компонентов свыше .1000 дальтон. Затем фильтрат подвергают дальнейшему разделению в элек- 25 трофоретической камере. В результате последовательного использования этих методов удается выделить пик, содержащий чистый р -экзотоксин. Концент-. рацию экзотоксина определяют по калибровочной кривой поглощения на длине волны 260 нм в кювете с оптическим путем 10 мм.

На фиг. 1 показана принципиальная схема выделения р -экзотоксина из культуральной жидкости;. на фиг, 2 график распределения вещества после электрофореза в свободном потоке на выходе из камеры разделения, на фиг. 3 -- зависимость оптической плотности от концентрации В -экзотоксина.

Устройство для выделения Р --экзотоксина содержит ультрафильтрационную ячейку 1, диалиэную мембрану 2, баллон 3 с сжатым газом, проточную электрофоретическую камеру 4, элек- 45 тродные отделения 5, коллектор 6 с набором пробирок и емкость 7 для несущего буфера.

Пример. Через ультрафильтрационную ячейку 1 с диализной мембра- я) ной 2 площадью 5 см пропускают культуральную жидкость. Фильтрацию проводят с помощью баллона 3 со сжатым азотом при давлении порядка 6-7 атм, Объемная скорость фильтрации при этому составляет 0,01 cM /ìèí. При скорости фильтрации 0,02 см /мин получают аналогичный результат. С этой же ско. ростью фильтрат подают в электрофоретическую камеру 4, в которой через электродные отделения 5 от источника питания подается постоянное электрическое напряжение. При этом в камере протекает электрический ток с плотностью 0,1 А/см, что обеспечивает и оптимальное выделение экзотоксина иэ фильтрата при времени разделения

2,5 мин. Аналогичный результат получают при плотности тока О, 12 А/см .

В качестве электрофоретический камеры используют ячейку с размерами

300к60к0,5 мм, Несущий буфер 0,01 И триэтаноламинфосфат с рН 7,5 непрерывно подается в рабочий зазор камеры из емкости 7. Образец (фильтрат культуральной жидкости) и поток несущего буфера непрерывно отбирается на выходе из камеры с помощью коллектора

6 с набором пробирок. После отбора фракций по 2 мл в отдельные пробирки с помощью спектрофотометра в кювете толщиной 10 мм на длине волны

?60 нм определяют распределение оптической плотности вдоль электрического поля камеры . На фиг. 2 показан результат распределения вещества после электрофореза в свободном потоке на выходе из камеры разделения. Стрелкой указано место ввода образца в камеру, Из. рисунка видно, что вещество на выходе из камеры распределено в виде трех пиков, имеющих разное отклонение в электрическом поле и отличающихся по

ЭФП.

С помощью метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках "Silufol" установлено, что третий пик на кривой распределения оптической плотности соответствует чистому Р -экзотоксину, следовательно, экзотоксин имеет максимальную ЭФП в сравнении с остальными компонентами фильтрата.

Получаемый препарат Р -экзотоксина электрофоретически и хроматографически чист и не содержит примесей.

Специальные биологические тесты показывают также, что выделенный препарат экзотоксина обладает биологической активностью. По суммарной величине поглощения в третьем пике и с использованием калибровочной кривой поглощения в кювете 10 мм на длине волны

260 нм для чистого Р -экзотоксина определяют концентрацию экзотоксина в пике с точностью 10 (фиг, 3).

1401042

Для данного случая концентрация Р -эк- Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я зотоксина составляет 0,045 мг/мл.

Способ определения термостабильПредлагаемый способ выделения ного р -экзотоксина Bacillus thurin-

5 позволяет повысить выход термостабиль- giensis путем очистки культуральной ного р -экзотоксина до 98-997 вместо жидкости с последующей идентификаци50-ЗОЖ по известному способу, ловы- ей и спектрофотометрией о т л и—

У сить точность количественного опреде- ч а ю шийся тем что с целью

t t ления Р -экзотоксина в культуральной 10 повышения точности и ускорения спосожидкости до t10X вместо 50Х и сокра- ба, очистку проводят ультрафильтратить в два раза минимальное время, цией через диализную мембрану с понеобходимое для определения экзоток- следующим электрофорезом в свободном сина (до 20 мин). Указанное время потоке буфера, содержащего 0,01можно уменьшить до 5 мин, если исполь-1б 0,005 M фосфат рН 7,0-8,0 при плотзовать на выходе из камеры разделения . ности тока 0,1-0,12 А/cM, времени проточную кювету спектрофотометра разделения 150-200 с и скорости подаобъемом 0,1-0,2 см чи фильтрата 0,02-0,05 см/с.

Длтичес каю

Молмоаим оаа

1401042 ода п,юо

О И

L7 080

Составитель А.Агуреев

Техред М.Дидык

Редактор Н.Яцола

Корректор В.Бутяга

Заказ 2768/26

Тираж 520

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 го

unmuvecхая ллогл.мсюь

Ц 050 кОИЦЯНЯД0ЦОЯ

vz/ ю