Штамм бактерий bacillus меgатеriuм-продуцент металлопротеиназы

 

Изобретение относится к биотех- . нологии и может применяться в различных отраслях народного хозяйства и медицине. ГГредлагается штамм Bacillus megateriun BKIIM В-ЗЧ37-продуцент металлопротеиназы, получен с помощью селекционных методов из штамма В.те- gaterium ЦМ1М В-603 с использованием молочного агара с добавкой дрожжеполисахаридной среды в качестве селективного фактора. Штамм-продуцент BKIIM-3937 за 23-25 ч культивирования при 30°С с интенсивной аэрацией и перемешиванием секретирует металлопротеиназу в количестве 500 мг/л культуральной жидкости, что в 2 раза больше по сравнению с из - BectHbM штаммом В.negaterшто-продуцентом металлопротеиназыо Специфическая металлопротеиназа, выделяемая культурой B.megaterium, может быть использована при производстве аспартама-пищевого подсластителя, которьй в 200 раз слаще сахара. (Л . 4 О ;О to

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С. 12 N 9/52 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО-ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4258893/31-13 (22) 09.06.87 (46) 30.11.88. Бюл. № 44 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промьплленньм микроорганизмов и Ладыжинский завод ферментных препаратов (72) Ф.С.Клепикова, Г.Г.Честухина, M.Å.Bîðìàòoâa, 3.T.Àáðàìîâ, В.М.Степанов, А.Г.Кондратюк, Л.В.Удовенко, В.В.Болоховский и Е.Ф.Григорьев (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N- 1240056, кл. С 12 N 9/54, 1984.

Люблинская Л.А. и др. Синтез и использование хромофорнык динитрофенильных субстратов металлопротеиназ, Биоорганическая химия, 1987, т.t3 ¹ 10, с.1331-1337.

Микробиологическая промышленность, Экспресс-информация, вып. 11, M., 1981, с.22.,Л0„„1440921 А1 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILI V$ ЫЕСАТЕRIVN — ПРОДУЦЕНТ МЕТАЛЛОПРОТИША3Ш (57) Изобретение относится к биотех- . нологии и может применяться в различных отраслях народного хозяйства и медицине. Предлагается штамм Bacillus megaterium BI<1M В-3937-продуцент металлопротеинаэы, получен с помощью селекционных методов иэ штамма В.megaterium ЦМПМ B-603 с использованием молочного агара с добавкой дрожжеполисахаридной среды в качестве селективного фактора. Штамм-продуцент BKIIM-3937 эа 23-25 ч культивио, рования при 30 С с интенсивной аэрацией и перемешиванием секретирует 9 металлопротеиназу в количестве

500 мг/л культуральиай жиикасти, чта И. в 2 раза больше по сравнению с из - ( вестным штаммом В.megaterium-продуцентом металлопротеинаэы. Специфическая металлопротеиназа, выделяеФ йй мая культурой В.megaterium, может быть использована при производстве аспартама-пищевого подсластителя, который в 200 раэ слаще сахара. СР с©

1440921

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, и касается нового штамма бактерий, продуцирующего внеклеточную металлопротеиназу (нейтральную протеиназу).

Металлопротеиназы Ыироко используются в народном хозяйстве и могут

1 применяться в медицине и парфюмерии, при производстве пищевых продуктов и напитков., кожевенной промьш ленности.

Штамм Вас 1lus megaterium ВКПИ

3-3937 получен из штамма Bacillus

megaterium ЦМПМ В-603 в результате применения селекционных методов с использованием молочного агара с добавлением дрожжеполисахаридной среды в качестве селективного фактора.

При культивировании на дрожжеполисахаридной среде в течение 23-25 ч при 30 С штамм ВКПМ В-3937 выделяет только один фермент — металлопротеиназу, активность которого no,ãèäðoëè- 25 эу азоказеина достигает 160 ед/мп, а при определении на синтетическом субстрате 1,8 ед/мл, что соответствует продукции 500 мг фермента на л культуральной жидкости. Протео- 30 литическая активность на казеиновом субстрате по модифицированному методу Ансона составляет в среднем

9,4 ед/мл (с колебаниями активности от 7,6 до l2,6 ед/мп), Металлопротеинаэа (нейтральная протеиназа), продуцируемая с помощью штамма BKIIN В-3937, обладает устойчивостью к ингибированию высокими концентрациями реагентов, что отличает ее от металлопротеиназ, секретируемых другими видами микроорганизмов. Зта специфическая особенность фермента является важной для ее использования в народном хозяйстве при синтезе интенсивного подсластителя — аспартама.

Культурально-морфологические приз наки штамма В.megaterium ВКПМ В-3937.

Морфология. Грамположительная палочка размером 2,0x5,0х1,2=1,5 мкм.

Образует овальные споры с центральным расположением в клетке.

Мясо-пептонный агар (ИПА) без о глюкозы. На 4-е сут роста при 30 С образует плоские шероховатые прозрачные колонии диаметром 9-10 мм с ровными краями, пигмент не выделяет, споры не образует.

Мясо-пептонный агар с 1%-ной глюкозы и агар Хоттингера с 1%-ной глкго козы. На 4-е сут роста при 30 С образует приподнятые над субстратом колонии диаметром 7-8 мм гладкие . блестящие с ровными краями беловатосерого цвета, пигмент в среду не выделяет, обильно спорулирует.

Среда Bergey № 1 с дрожжевым экстрактом. На 4-е сут роста при о, 30 С образует матовые плоские в центре мелкоскладчатые к краю колонии диаметром 9-1 0 мм с фестончатыми краями белого цвета, пигмент в среду не выделяет, споры не образует.

Синтетическая среда Green u о

Slepecka. На 4-е сут роста при 30 С образует белые блестящие колонии диаметром "-4 мм с ровными краями, образует споры.

Молочная среда. На 4-е сут роста о при 30 С образует плоские шероховатые колонии диаметром 7-9 мм матовые белого цвета с ровными краями, пигмент в среду не выделяет, споры образует.

Среда L + глюкоза 1%. На 4-е сут о роста при 30 С образует плоские шероховатые матовые колонии диаметром

13-15 мм белого цвета с ровными краями, пигмент в среду не выделяет, споры образует.

Казеиновая среда. На 2-е сут роста при 30 С образует гладкие блестящие колонии диаметром 13-14 мм белого цвета с ровными краями, пигмент в среду не выделяет, обильно спорулирует. На 3- 4-е сут отмечается лизис культуры.

Посев уколом в столбик с казеиновой средой. Сплошной рост на поверхности столбика, внутри агара рост отсутствует — аэраб.

Рост в жидких питательных средах.

При посеве на жидкую питательную среду ИПБ с глюкозой и среду Bergey

¹ 1 с глюкозой без встряхивания наблюдается слабое помутнение среды, пленка отсутствует, образуется осадок скудный рыхлый слизистый.

Картофель. Рост обильный, поверхность слизистая серовато-белого цвета, пигментация отсутствует.

Биохимические свойства.

Желатину активно разжижает.

Молоко пептонизирует и коагулирует.

1440921

Фор.мула изобретения

2,5-3 0

Редактор M.Недолуженко Техред А. Кравчук Корректор Л.Патай

Заказ 6143/29 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Нитраты восстанавливает в нитриты.

Крахмал гидролизует.

Отношение к углеводам и спиртам.

Усваивает арабиноэу, глюкозу, ксилозу, манноэу, лактоэу, мальтозу, галактозу, сахарозу, маннит, глицерин.

На 6-7 день роста при 30 С на глюкозе, глицерине, сахароэе, мальтозе и арабинозе сильно подкисляет среду, на лактозе, галактозе и макните подкисление среды слабое, на маннозе и ксилоэе рН не меняется.

Рост на ксилоэе и галактозе сопровождается выделением газа.

Отношение к лизоциму. Воздействие лизоцимом в концентрации 40 мг/мл в течение 1 ч при 37 С вызывает гио бель 63/ клеток.

Штамм хранят в виде лиофильно высушенной культуры, а также на агарчзованной картофельной среде с 2 ной глюкозы, среде L с 1 -ной глюкозы, под вазелиновым маслом и в гли-, церине.

Пример 1. Штамм В.megaterium

BIGIM В-3937 выращивают в течение

4-5 сут на картофельном агаре — среде с картофельным отваром (300 r картофеля на 1 л воды),; содержащем, : глюкоза 2,0, агар-агара 2,0, осталь-, ное картофельный отвар до 1л, рН 7.0.

Засев питательной среды проводят .или вегетативными клетками, или суспензией спор, которую подвергают предварительной термообработке при о

65 С в течение 15 мин в количестве

6 I0 на 1 мл среды.

В качестве ферментационной среды используют дрожже-полисахаридную (ДПС) среду следующего состава, мас. :

Белково-витаминный концентрат иэ дрожжей

Кукурузная мука 2,0

Сас1, 0,3

Вода До1л рН 7,5-7,6 до стерилизации.

Через 23 ч культивирования максимальный уровень накопления металлопротеинаэы в супернатанте культуральной жидкости составляет 1,8 ед/мл

10 при определении на синтетическом субстрате DNP-Gly-Gly-Ile-Arg u

160 ед/мл при определении активности с использованием в качестве субстрата азоказеина, что соответствует

1б продукции 500 мг на 1 л. Активность по модифицированному методу Ансона достигает 9,4 ед/мп.

Пример 2. Выращенную в кол20 бах по примеру 1 культуральную жидкость В.megaterium BKIM В-3937 6-часового возраста пересевают в 10-лит- . ровый ферментер на опытно-промышленной установке в количестве 10/ по

25 объему.

Культивирование в аппарате ведут при аэрации 1:1 и перемешивании

800 об/мин при 30 С. В качестве пеногасителя используют ниоген. Через

З0 27 ч роста количество фермента в культуральной жидкости составляет

500 мг/л.

Применение штамма с использованием простой относительно дешевой

35 среды позволяет увеличить рентабельность промышленного производства специфической металлопротеинаэы, необходимой для производства аспартама.

Штамм бактерий Bacillus megaterium

ВКПМ В-3937 — продуцент металлопротеиназы.