Вектор рмв 123 для получения фрагментов днк с произвольными липкими концами и способ его конструирования

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии и представляет собой векторную ДНК рМВ 123 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами. Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК имеет молекулярную массу 1,8 МД и содержит EcoR I - Pst I фрагмент ДНК плазмиды PVR 222 с геном В-лактамазы и частью модифицированного гена й-галактозидазы E.coli, а также синтетический полилинкер длиной 38 п.о. Полипинкер включает между попарными сайтами Fok I и Hga 1 набор сайтов для эндонуклеаз рестрикции SalG I, Асе I, Hind II, Hind III и Bam HI противоположной полярности. Целевые фрагменты ДНК получают путем клонирования субфрагментов в составе сконструированной векторной плазмиды . рМВ 123 по сайтам, содержащимся между попарными сайтами Fok I и Hga I с последующим их выщеплением с помощью рестриктаз Fok I или Hga I. 2 с.п. ф-лы. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.(59 4 C 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОЮИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАЮ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4149175/28-13 (22) 17.11.86 (46) 23. 12.88. Бюл. Ф 47 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) А.Н.Синяков, О.И.Серпинский, Н.К.Данилюк, С.Х.Дегтярев.и В.Е.Чижиков (53) 575.224.2.577.2(048)(088.8) (56) Доклады АН СССР. 1984, т. 278, И 5, с. 1250-1253. (54) ВЕКТОР рМВ 123 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ФРАГМЕНТОВ ДНК С ПРОИЗВОЛЬНЫМИ ЛИПКИМИ КОНЦАМИ И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВА-

НИЯ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии и представляет собой векторную

ДНК рМВ 123 для получения фрагментов

ДНК с произвольными липкими концами..80„, 1446159 А1

Полученная рекомбинантная плазмидная

ДНК имеет молекулярную массу 1,8 МД и содержит EcoR I — Pst I фрагмент

ДНК ллазмиды PVR 222 с геном В-лактамазы и частью модифицированного гена В-галактозидазы Е.coli а также синтетический полилинкер длиной

38 п.о. Полилинкер включает между попарными сайтами Fok I u Hga I набор сайтов для эндонуклеаз рестрикции SalG I, Асс I, Hind II, Hind III и Bam HI противоположной полярности .

Целевые фрагменты ДНК получают путем клонирования субфрагментов в составе сконструированной векторной плазмиды . рМВ 123 по сайтам, содержащимся между сайтамн Fok I u Hga с последующим их выщеплением с помощью рестриктаз Fok I или Hga I

2 с.п. ф-лы.

1446159

GGATGACGCGTCGACAAGCTTGGATCCGCGTCATCCAG

ACGTCCTACTGCGCAGCTGTTCCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA;

GGATGACGCG;

GATCCGCGTCATCCAG; (ЕЕЕ) (IV) GAATTCTGGATGACGCCG

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению векторных рекомбинантных ДНК методами генетической инженерии и может найти применение в биотехнологии при создании штаммовпродуцентов целевых продуктов, с находящимися между попарными сайта-. ми эндонуклеаз рестрикции Fokl и 15

HgaI местами для эндонуклеаз рестрикции SalGI, AccI, HindII, HindIII u

BamHI.

Конструирование вектора рМВ 123 проводят следующим образом. 20

Расщепляют ДНК плазмиды pNINB эндонуклеазами рестрикции BamHI u

EcoRI и лигируют полученный гидролизат с синтетическими.олигонуклеотидами GATCCGCGTCATCCAG u AATTCTGGAT- 25

GACGCG с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки Е.coli ВМН 7118 или ЕМ

103 и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину,с.фенотипом Ьас" 39 (промежуточная плазмида рМВ 121) .

Из индивидуальных клонов выделяют ДНК плазмиды рМВ 121, которую расщепляют эндонуклеазами рестрикции PstI u

SalGI и лигируют с олинонуклеотидами

GGATGACGCG u TCGACGCGTCATCCTGCA.Ïoäó- ченной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фенотипом Lac (плазмида рМВ 123). 40

Конструкция рМВ 123 облегчает поиск колоний с рекомбинантными плазмидами. Поскольку полилинкер для клонирования субфрагментов расположен в кодирующей последовательности 1 — 45 пептида В-галактозидазы,вставка суб фрагмента может нарушить его рамку считывания и привести к изменению фенотипа, полезному для селекции рекомбинантов.

В качестве клетки-хозяина при работе с вектором рМВ 123 удобно использовать E.coli с делецией в начале гена В-галактозидазы, например, Е.coli Lac ZDN 15. Плазмида рМВ 123 благодаря Ы-комплементации с хромосомным геном ЬacZ сообщает таким бактериальным клеткам фенотип Lac

+ который при нстанке субфрагмента обЦел ь и зобр ет ения — создание вектора, позволяющего получать клонируемые в нем фрагменты ДНК с произвольными "липкими" концами.

Сконструирован вектор рМВ 123, состоящий из EcoRI-PstI фрагмента

ДНК вектора PVR 222 и полилинкера: щей длиной Зп +Е п.о., либо если внутри его находится ATG-кодон, содержа- . щий Зп или 3n+I п.о. от этого ATGкодона до 3 -конца субфрагмента, из/ меняется на Lac что позволяет легко отбирать колонии с рекомбинантными плазмидами (не окрашенные на индикаторной среде с Х-Gal), Пример 1. Химический синтез олигонуклеотидов

TCGACGCGTCATCCTGCA; (II) :проводят твердофазным фосфотриэфирным методом. В качестве носителя используют модифицированный силохром. Наращивание олигонуклеотидной цепи

t проводят от 3 — к 5 -концу с помощью динуклеозиддифосфатных производных (МвО)

80 -ной водной уксусной кислоте и выдерживают при комнатной температуре

45 мин..Раствор упаривают досуха, растворяют остаток в 1 мп дистиллированной воды и хроматографируют на

Lichrosorb PR 18 в 0,05 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила

5-20 .

Конструирование целевой векторной

ДНК рМВ 123 состоит из двух этапов, На первом этапе конструируют.промежуточную плазмидную ДНК рМР 121, 1446! 59

Пример 2. Получение субфраг мента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую

60-98 аминокислотам человеческого интерлейкина-2, с заранее запланированными "лнпкипи" концами.

Описанным способом синтезируют и выделяют следующие полииуклеотиды:

5CCCAGATCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAAGAAGTG; (V) 5GAAAATTTTTGATTTGTGCTAAATTCAGCACTTCTTCCAG (VI) 5ACTTACGTCCCCGTGACTTAATCTCCAATATCAACGTTAAT; (VII) 5CCTGTCGACCCTTCAGTTCCAGTACAATTACGTTGATA (VIII)

Из полинуклеотидов V-VIII получают этанол), нагревают 10 мин при 50 С, дуплексы для клонирования. охлаждают до 20 С, добавляют йНТР до

Реакционную смесь, содержащую по концентрации 250 мкм и 10 ед. ДНК-по100 пкмоль меченного g-Р ATP поли- лимеразы 1 (фрагмент Кленова). Реак 3Ч.

55 нуклеотида (Ч) и фосфорилированного ционную смесь инкубируют 30 мин при холодным ATP полинуклеотида (VI) в . 20 С, добавляют 10 мкл 0,4 М ЭДТА, 100 мкл буфера 3 (60 мМ трис-НС1, рН 8,0 и экстрагируют водным фенолом. рН 7,5; 10 мМ МлС1, 19 мМ 2-меркайтод- . ДНК-дуплекс осаждают ацетоном, содер5 мкг ДНК плазмиды рИПБ гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции BamHI u EcoRI в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 (20 мМ трис-НС1 рН 7,8,10 мМ MgC1, 10 мМ 2 — маркаптоэтанол) и 100 мМ NaC1 при 37 С 1 ч.

Реакционную смесь после добавления

5 мкл 0,4 M ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и изо- 10 амилового спирта. Затем к реакционной смеси добавляют NaAc до концентрации 0,3 М, рН 7,0 и осаждают ДНК двумя объемами этанола. Полученный препарат вектора pNIMB растворяют в 15

50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1, рН 7,8; 1 мМ ЭДТА).

К 5 мкл раствора вектора pNIMB добавляют по 20 пмоль олигонуклеотидов (III и IU), 2 ед. ДНК-лигазы фа- 20 га Т < в 30 мкл буфера 2 (20 мМ трисНС1; рН 7,5, 10 мМ MgC12, 10 мМ 2 маркаптоэтанол и 0,5 мМ ATP) .

Реакционную смесь выдерживают

12 ч при 10 С, затем используют для 25 трансформации клеток E.coli ВМН 7118.

Суспензию клеток после трансформами высевают на 1,5 LB агар, содержащий

75 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл, Х-Gal.×àøêè инкубируют 12 ч при 37 С, 30

Из колоний, имеющих Ьас фенотип, щелочным методом выделяют ДНК плазмиды рМВ 121. BspI и FokI гидролизаты полу енной ДНК анализируют в 4 ПААГ.

Клон, имеющий дополнительный Рок Хсайт в плазмидной ДНК, выращивают в 100 мл среды, содержащий 50 мкг/мл о апициллина, в течение 16 ч при 3? С на качалке (200 об/мин). Клетки собирают центрифугированием (6000 об/мин, 40

10 мин, 4 С), плазмидную ДНК рМВ 121. выделяют щелочным методом с последующей дополнительной очисткой в градиенте плотности СsC1.

5 мкг ДНК плазмиды рМВ 121 расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции PstI в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 и 50 мМ NaC1 1 ч при о

37 С. Затем к реакционной смеси добавляют NaC1 до концентрации 150 мМ, 2-меркаптоэтанол до 20 мМ и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции SalGI, выдер-: живают 1 ч при 37 С. Реакционную смесь после добавления 6 мкл 0,4 М

ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и изоамилового спирта, ДНК вектора рМВ 121 осаждают этанолом и растворяют в 50 мл ТЕбуфера.

5 мкл раствора ДНК плазмиды рМВ

121 отбирают для получения вектора рМВ 123. К реакционной смеси добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов

I и II, 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в 30 мкл буфера 2 и выдерживают 12 ч при 10 С. Полученной лнгазной смесью трансформируют клетки Е.coli ВМН

7118. Из колоний (получежюе см.выше) имеющих Lac фенотип, выделяют плазмидную ДНК. После рестрикционного анализа с помощью BspI u FokI эндонуклеаз определяют ее первичную структуру в районе встроенного полилинкера по методу Максама-Гилберта.

1446159 жащим 2% LiC10, промывают спиртом, / высушенный осадок растворяют в воде., Полученный дуплекс расщепляют обработкой 200 ед эндонуклеазы Bgl II в 200 мкл буфера 2, содержащего

50 мМ NaC1 в течение 12 ч при 37 С, Аналогично получают дуплекс из полинуклеотидов (VII и VIII) который затем расщепляют обработкой 500 ед. 10 эндонуклеазы SalGI в 200 мкп буфера

2, содержащего 150 мМ NaC1, в течение 12 ч при 37 С. Оба рестрикта выделяют с помощью гель-электрофореза в 87. ПААГ. 15

Реакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовле :ных дуплексов и 0,25 пмоль векторной ДНК, получен- ной из рМВ 123 совместным расщеплением эндонукпеазами рестри;- .:зии BamHI 20 и SalGI (условия см, выше), обрабатывают 2 ед. ЦНК-лига.зы в описанных условиях, Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е,coli BNH

7118 или IN 103 ДНК, выделенные

25 из колоний, имеющих Las- фенотип, гибридизуют с Р-меченьпл зондами, полученными из полинуклеотидов (U и

VIII). ДНК, гибридизующиеся с обоими зондами., дополнительно анализи- ЗО руют с помощью BspI и EcoRI+PstI гидролиза.

Колонии, имеющие плазмиды plL 912 со вставкой требуемого размера, выращивают в il00 мп LB среды. Для полу.— чения целевого субфрагмента, коди-рующего часть гена человеческого

IL-2 с заранее запланированными "лип:-кими" концами, 15 мкг ДНК плазмиды

pIL 912 в 150 мкп "óôåðà 1, содержа- щ щего 50 мМ NaC1, обрабатывают 20 ед. эндонуклеазы регистрикции FokI или

HgaI при 37"С. Целевой фрагмент длиной 114 нуклеотидных пар выделяют с помощью электрофореза в 6Х ПААГ..

Структура полученного фрагмента подтверждена методом Максама-Гилберта.

Пример 3. Контроль на коньюгативность плазмиды рМВ 123. 50

Плазмидную ДНК pNB . 123 трасформируют по описанной методике в штамм

Е.coli BNH 7118. Колонии, выросшие при 37 С за 16 ч íà LB агаре с ампициллином (АР 50 кг/мл), пересевают в

LB-среду с тем же антибиотиком.и расTAT po ZUIOTHQcTH Д;5 — 1 . Но H jN культуру штамма IN 103 засевают и растят

;в тех же условиях да плотности Д -=1. Культуры смешивают в равных объемах по О, 5 мп, инкубируют 1 ч при

37 С, покачивая. После чего 100 мкл

ct,си высевают на 1,В агар, содержащей ангибиотики Ар (50 мкг/мл) и $сr (100 мкг/мп), и оставляют на ночь при 37 С. Стерильность, на чашках сохраняется. Эффективность коньюгации меньше 10, Таким образом, применение векторной пЛазмиды рМВ 123 для получения субфрагментов с заранее запланированными "липкими" концами имеет существенные преимущества по сравнению с прототипом. Прежде всего конструкция векторной ДНК рМВ 123, содержащая между гопарными сайтами эндонуклеаз рестрикции FokI u HgaI противоположной ориентации, набор сайтов для рестриктаз SalGI, AccI, HingIII, DamHI дает возможность клонировать фрагмент из нескольких частей и таким образом получать протяженные химически синтезированные последбвательности ДНК.

В примере 2 субфрагмент гена человеческого интерлейкина-2 получен из двух. дуплексов за одно клонирование.

Получение этого же субфрагмента в плазмидах типа pBBv потребует трех клонирований. В этом случае необходи-. мо проклонировать отдельно каждый иэ тупоконечных дуплексов, а затем после получения "липких" концов осуществить сборку в субфрагмент в другом векторе. Применение pNB 123 для получения целевых последовательностей

ДНК позволяет уменьшить объем биохимической и генно-инженерной работы в несколько раз. Несомненным преимуществом является использование при получении ппоизвольных "липких" концов субфрагментов коммерчески доступных эндонуклеаз рестрикции Fokl u HgaI.

Векторная плазмида рМВ 123, позволяющая получать субфрагменты с заранее запланированными "липкими" концами находит применение при получении .генов и их фрагментов, ценных белков, конструировании регуляторных элементов транскрипции и трансляции.

Формула изобретения

1. Вектор рМВ 123 для получения фрагментов ДНК с гроизвольными лип— кими концами смол массой 1,8 ЬЩ, содержащий -Ecorl-Pstl фрагмент ДНК

1446159

GGATGACGCGTCGACAAGGCTTGGATCCGCGTCATCCAG

ACGTCCTACTGCGCAGCTGTTCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA

25 фрагменты размером 8, 84, 181, 244, 287, 614, 1254 п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазы

FokI; вставку субфрагмента для клонирования по Sal, GI u BamHI-сайтам полилинкерной области; ген В-лактомазы, определяющий устойчивость к ампициллину, емкость не менее 622 п.о., 30

Составитель Т. Забойкииа

Редактор Н.Гунько Техред Л.Олийнык Корректор A-Оoбручар.

Заказ 6706/30 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 плазмиды рЧК 222 с репликоном плазмиды pVR 222 геном й-лактамазы и частью модифицированного гена И-галактозидамежду попарнымн сайтами эндонуклеаз 10 рестрикции FokI u HgaI которого расположены сайты для эндонуклеаз рестрикции SalGI, AccI, HingII, HingIII и BamHI противоположной полярности; фрагменты размером 11, 80, 100, .174,15

257 (область полилинкера), 267, 290, 434, 457, 587 п.о., образующиеся после расщепления эндонукпеазы Bspl; фрагменты размером 26, 34, 67, 20

110, 147, 200, 242, 404, 420 (область полилинкера) 489, 500 п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазы

ДНК," зы Echerichia coli, синтетический полилинкер размером 38 п.о., имеющий структуру штаммы-хозяева: штаммы Е.cbli с

LacZ ЙМ15 фенотипом.

2, Способ конструирования нектора рМВ 123 для получения фрагментов

ДНК с произвольными липкими концами, заключающийся в том,что ДНК pNIMB расщепляют с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI, полученную векторную ДНК лигируют с синтетическими олигонуклеотидами GATCCGCGTCATCCAG u AATTCTGGATGACGCG с помощью

ДНК-лигазы фага Т4, лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli из трансформанты, имеющих фенотип Lac выделяют ДНК, расщепляют эндонуклеазами рестрикции Pstl и Ва1СЕ, выделяют векторную ДНК, которую лигируют с синтетическими олигонуклеотидами

GGATGACGCGTCGACGCGTCATCCTGCA с помощью ДНК-лигазы фага Т4, вновь трансформируют клетки Е.coli среди транс. формантов, устойчивых к ампицкплину и имеющих фенотип Lac отбирают клоны, имеющие целевую первичную структуру ДНК в районе полилинкера плазмиды.