Способ получения полинуклеотидфосфорилазы из клеток

 

Шобретение относится к биохимии и биотехнопогий и iMMtet быть использовано для ло/ чения в лреларапгивных кхтичествах ферментного Лреларата лолинукпеотидфосфортаэы (ПНФазы 1 широко гфименяемой для оттеза полинуклеотцдоа Цель изобретений - ловьвиеше выхода ПЙФазы и упрощеше слособа Биомассу EschericWa col В ра ушают в гфисутствии лизоцима Полученную клеточную суслензию лодвергают термообработке лри 56 - 580С в течение 2 - 20 мин в буферном рааворе. содержащем дeкap i лолютиленгликоль и хлористьм натрий в конц& трациях (мас%) 05 - ОЙ 25 - 3.0 и 610 - 9D соответствен). Целевой лродукт о мщают хромотографией на ДЭАЭ- целгаолозе и ДЭАЭ-сефадексе. Предлж-аемьм слособ лозволяет улростить гцюцесс и ловысип выход ПНФазы в 2 - 25 раза 2иа

(19) Я1 (11) (5Ц 5 С 12N 14

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЯИСТИЧЕСКИХ РЕСПЗ ВЯИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССУ) 1 (21) 4173116/13 (22):271036

{46) 30.1233 Бк)п. Ne 47-48 (7фйаувю-иаяедоватеъсний конструкторскотеаюлегичесем ектитут биологически активных

{n) Герье an. Срн о НА. Подг рыйвФ. (7® НА0 "Вектор"

{ю>жавов поъчаая полвеиааедaaasalNalt3 IUIKtOK

{ЩИзобретеие относится к биоюеам и биотехиопегю и мо)кет быль использовано дпя получемя I рета попинукпеотидфосфорипазы (ПНФазьф широко применяемой для синтеза полинукпеотидоа

Цель изобретения — повышение выхода ПЙФазы и упрощение отособа Биомассу Escherichia cali . В разрушают в присутствии пизоцима Полученную клеточную суспензию подвергают термообработке лри 56 — 58 С в течение 2 — 20 мин в буферном растворе; содержащем декстрац полиэтиленгликоть и хпористый натрий в концентрациях (мас%)

05 — Оа2,5 — ЭОи60 — аОстветстмю, цлевой продукт очищают хромотографией на ДЭАЭцеллюлозе и ДЭАЭ-сефадексе. Предлагаемый овсоб позволяет упростить процесс и повысить выход ПНФазы в 2-2,5 раза 2 ив

1453893

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для получения в препаративных количествах ферментного препарата полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) для использования в синтезе полинуклеотидов или для иных целей.

Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа.

На фиг. 1, 2 даны графики зависимости и концентрации ПНФазы в верхней фазе соответственно от концентрации соли (хлористого натрия) и от температуры обработки.

Способ осуществляют следующим образом. Культивируют продуцент — Escherichia соИ В до максимального накопления фермента. Биомассу отделяют в буферном растворе. содержащем 2 мМ дитиотреитол (ДТТ), куда добавляют лизоцим в количестве 2 мг/г клеток. Смесь выдерживают 45 мин при 4 С,,Затем в суспенэию добавляют растворы дексграна, полизтиленгликоля и натрия хлористого до конечных концентраций (мас,%)

0,5-0,9; 2,5-3,0; 6,0 — 9,0 соответственно и смесь подвергают термообработке при 56—

58 С в течение 2-20 мин. После охлаждения смеси ее центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин и верхнюю фазу подвергают очистке хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и ДЭАЭ вЂ” сефадексе. Выход целевого продукта ПНфазы составляет 40—

45 ед.акт,/г клеток. препарат фермента обладает высокой функциональной чистотой.

В случае большого масштаба выделения фермента термообработку проводят в проточном аппарате, Аппарат состоит из двух теплообменников и перистальтического насоса. В первом теплообменнике смесь нагревают до 56-58 С и выдерживают в течение 2-20 мин, а во втором охлаждают до 5-10 С.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Операции очистки проводят при 0-5 С. 100 г замороженных клеток

E.coll суспендируют в 300 мл буфера {0.02 моль/л трис-HCI pH 8, l: 2 ммоль/n QTT), B суспензию добавляют 200 мг лизоцима, растворенного в 2 мл буфера. Смесь выдерживают в течение 30-40 мин при 0-5 С, постоянно перемешивая, затем добавляют

24 мл 20%-ного раствора декстрана (мол,м, 500000), 48 мл 40%-ного раствора полиэтиленгликоля (мол,м, 6000). 178 мл (4 моль/л) хлористого натрия (до конечных концентраций О,В; 2,9 и.6% соответственно) и 63 мл исходного буфера.

Смесь перемешивают и с помощью перистальтического насоса пропускают через

Пример 3. ПНФазу выделяют из 100

r клеток по примеру 1, но добавляют декстран, полиэтиленгликоль и хлористый натрий до концентраций 0,3; 2 и 2,5 соответственно, При этом образуется мутная ПЭГ-фээа(примеси нерастворимых компонентов), а выход целевого продукта составляет 5 ед.акт,/г клеток.

Пример 4. ПНФазу выделяют из 100 r клеток по примеру 1, но используют декстран. полиэтиленгликоль и натрий хлористый в концентрациях 1; 3,2; 12% соответственно. Термообрэботку проводят при 58 С. е течение стеклянный теплообменник с теплоносителем при 57 С, а затем через теплообменник, охлаждаемый ледяной водой. Скорость прокачки выбирается такой, чтобы время нахождения смеси в первом теплообменнике было около 10 мин, Охлажденную смесь центрифугируют при скорости 3000 об/мин в течение 20 мин. Верхнюю фазу сливают и диализируют против исходного буфера до

10 снижения концентрации хлористого натрия до 0.15 моль/л. Затем диализат наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (ЧУ=100 мл) и после промывки элюируют 1 л буферного раствора с линейным градиентом хлористо15 го натрия до 0,15 моль/л, Затем диализат наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (Нк=100 мл) и после промывки элюируют 1 л буферного раствора с линейным градиентом хлористого натрия 0,15 — 0,5 молb/л. Ак20 тивные фракции обьединяют и добавляют сульфат аммония до 85%-ного насыщения.

Осадок отделяют центрифугированием растворяют в 30 мл буфера (0,02 моль/л трисНО рН 7,5, 2 ммоль/л ДТТ). Раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-сефадексом {Vk=100 мл) и после промывки буфером, содержащим

0,25 моль/л натрия хлористого, злюируют фермент буфером с линейным градиентом концентрации натрия хлористого 0,25 — 0,5

30 моль/л.

Активные фракции объединяют и концентрируют диализом против насыщенного раствора сульфата аммония в буфере (0,02 моль/л трис-НО.рН 8,1, 2 ммоль/л ДТТ).

После диализа осадок отделяют центрифугированием и, растворив в небольшом количестве буфера. диалиэируют против него в течение 15-20 ч.

Выход ПНФазы 45 ед.акт./г биомассы.

40 Пример 2. ПНФаэу выделяют иэ 100

r клеток по примеру 1, но используют декстран. полиэтиленгликоль и хлористый натрий в концентрациях 0,5; 2,5 и 9 соответственно. Термообработку проводят

45 при 56 С. Выход ПНФазы 40 ед.акт,/г клеток, 1453893 мония и последующий диализ, 50 отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения способа, извлечение фермента осуществляют путем термообработки суспензии клеток е буферном растворе, со55 держащем декстран, полиэтиленгликоль и хлористый натрий соответственно в концентрациях, мас. : 0,5 - 0,9; 2,5 - 3,0; 6,09,0, при 56 - 58 С в течение 2 - 20 мин.

10 мин. Выход целевого продукта — ПН Фазы

20 ед,акт,/г клеток.

Пример 5. ПНФазу выделяют из 100 г клеток по примеру 1, но термообработку проводят в течение 1 мин, Выход целевого продукта 16 ед.акт./г клеток.

Пример 6. flHФазу выделяют из 100 r клеток по примеру 1, но термообработку проводят в течение 25 мин, Выход целевого продукта 37 ед.акт./r клеток, Пример 7. ПНФазу выделяют иэ 100 г клеток по примеру 1, но варьируют концентрацию хлористого натрия от 0 до 9 Pe аул ьтаты представлены на фиг. 1.

Максимальный выход фермента отмечен при концентрации NaCI 6-9

Пример 8. ПН Фазу выделяют иэ 100 г клеток по примеру 1, при этом температуру термообработки варьируют от 0 до 70 С.

Результаты, представленные на фиг, 2, свидетельствуют о том, что максимальный выход фермента происходит при температуре

56-58 С.

Пример 9. ПНФаэу выделяли из 100 г клеток по примеру 1, но термообработку проводят в течение 2 мин. Выход целевого продукта — ПНФазы 44 ед.акт./г клеток.

П ри мер 10. ПНФазу выделяютиэ100г клеток по примеру 1, но термообработку проводят в течение 20 мин. Выход целевого продукта — ПНФазы 45 ед,акт./г клеток, Пример 11, 10 г замороженных клеток суспендируют в 30 мл известного буфера, содержащего 0,1 мол ь/л имидазол-H CI, р Н

7,0, 0,25 моль/л NaCI, и разрушают ультразвуком — 4 раза по 30 с на дезинтеграторе

УЗДН-2. Затем суспенэию разбавляют буфером до 80 мл и центрифугируют на центрифуге J2-21 при 20000 об/мин в течение 20 мин. Осадок вновь суспендируют в 20 мл буфера и "озвучивают" в том же режиме.

Суспензию объединяют с супернатантом (V=100 мл) и добавляют растворы декстрана, полиэтиленгликоля и натрия хлористого до конечных концентраций 0,7; 2,7 и 7% соответственно. Смесь перемешивают и прогреФормула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ КЛЕТОК

Escherichla coil В, включающий культивирование продуцента до максимального накопления фермента, отделение биомассы, суспендирование ее в буферном растворе, разрушение клеток. извлечение фермента иэ клеточной суспенэии, очистку хроматографией. концентрирование сульфатом ам5

45 вают в проточном теплообменнике с теплоносителем при 57 С в течение 10 мин и охлаждают ее. Смесь центрифугируют при

3000 об/мин в течение 20 мин, верхнюю

ПЭ Г-фазу после диализа наносят на колонку с ДЭАЭ-сефадексом (1,6х20 см) и после промывки колонки проводят элюцию градиентом 0,25 — 0,4 моль/л NaCI. Объем градиента

200 мл. Активные фракции объединяют и осаждают белок 80-",ь-ным сульфатом аммония. Осадок растворяют в 0,01 моль/л трисHCI-буфера рН 8,4. содержащего 0,001 моль/л ЭДТА, 0,001 моль/л P меркаптоэтанола и 0,1 моль/л NaCI. Полученный раствор подвергают очистке на колонке с сефадексом G 200 (2,6х80 см), собирают активные фракции, объединяют и концентрируют осаждением сульфатом аммония; Осадок растворяют в трис-HCI-буфере рН 8 4 и после диалиэа против этого же буфера получают готовый продукт — препарат ПНФазы. В результате из 10 г клеток (биомассы) получают 380 ед,акт. ПНФазы или 38 ед.акт./r c характеристиками, аналогичными указанным в примере 1.

Изобретение позволяет упростить аппаратурное оформление процесса за счет исключения стадий длительного высокоскоростного центрифугироеания и ультразвукового разрушения клеток, существенно повысить выход целевого продукта с 16,5 ед,акт. до 45 ед,акт. иэ 1 г клеток продуцента, снизить трудоемкость процесса за счет упрощения и увеличить выход целевого продукта. (56) Gillam, Smith M, Use of Е.coll, Polynucleotide phosphorylase for the

Synthesis of OlIgodeoxyrI bonucleotldes of

Defined Sequence — in Methods ln

Enzymology, 1980, ч. 65, р. 687 — 693.

Багдонас А.С., Сабаляускене B.Ë„ IOoäKa Б.А. Выделение полинуклеотидфосфорилаэы из Е.coll и некоторые ее свойства, Биохимия, 1981, т. 46, вып. 5, с. 802 — 808, 1453893

@ Я б.

Квмцеирициа соли, Фиа1 тююм/алушта, с

Фи@f

Составитель . Е. Воробьев

Техред М.Моргентал Корректор М, Ткач

Редактор Г. Бельская

Заказ 3467

Тираж Подписное

HOO "поиск" Роспатента

113035, Москва; Ж-35; Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101