Штамм дрожжей jarrowia liроlyтiса-продуцент липазы и питательная среда для его культивирования

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в кожевенной и ме ховой промьшшенности, медицине и животноводстве , при получении синтетических моющих средств. Цель изобретения - получение штамма, обладающего Изобретение отно сится к микробио--. логической промышленности и представляет собой штамм дрожжей Jarrowia lipolytica, используемый для получения щелочной липазы, и среду для культивирования продуцента. Полученный фермент находит применение в кожевенной, меховой промышленности, также при получении синтетических моющих средств с ферментными добавками, также в медицине и животноводстве. Цель изобретения - получение нового штамма - продуцента липазы, обг высокой липолитической активностью и широкой субстратной специфичностью. Изобретение заключается в том, что путем многоэтапной селекции адаптивным методом получен штамм дрожжей Jarrowia lipolytica ВНИИ. 304А - активный продуцент липазы. Высокая липолитическая активность штамма и способность его усваивать различные субстраты обеспечивается питательной средой следующего состава, мас.%: этанол 0,29-0,62; кукурузное масло 0,1-0,5; аммоний сернокисльй 0,25-; 0,04; магний сернокислый 0,05-. 0,09; натрий хлористый 0,02-0,06; кальций углекислый 0,08-0,5; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1- 1,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 0,01-0,15; дрожжевой экстракт 0,01-0,02, вода водопроводная остальное . На новой среде штамм обеспечивает липолитическую активность 7500- 8000 ЛЕ/мл, стабилен в пределах рП 4-9,5 и.температуры 28-45 С. 2 с.п. ф-лы, 4 ил, 1 табл. 10 ладающего при культивировании на новой среде повьш1енной липолитической .активностью с расширением субстратной специфичности синтезируемого им фермента. Цель изобретения достигается тем, что в качестве продуцента липазы используют штамм дрожжей Jarrowia lipolytica 739. Штамм получен многоэтапной селекцией адаптивным методом на сусло-агаре и среде Ридер с последующим выделением активных вариантов, (О 1йь сд М ро (У1 N3

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4280036/31 -13 (22) 19.05.87 (46) 30.01.89. Вюл. 11 - 4 (71) Институт микробиологии им. Августа Кирхенштейна и Институт микробиологии АН СССР (72) И.С. Звягинцева, В.Т. Лука, А.О, Вецозола и Г.А. Пенцеле (53) 663.15(088.8) (56) Звягинцева И.С. Липазная активность некоторых дрожжей. — Микробиология, 1972, т. 4, вып. 1, 24-28.

Патент США N 3619372, кл. С 12 N 9/20, 1968. (54) ШТАММ ДРОЖЖЕЙ JARROMIA LIPOLYTICA — ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ И ПИТАТЕЛЬ-

НАЯ СРЕДА ДЛЯ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности и может быть использовано в кожевенной и меховой промышленности, медицине и животноводстве, при получении синтетических моющих средств. Цель изобретения — получение штамма, обладающего

Изобретение относится к микробио- . логической промьппленности и представляет собой штамм дрожжей Jarrowia . lipo1ytica, исгользуемый для получения щелочной липаэы, и среду для культивирования продуцента. Полученный фермент находит применение в кожевенной, меховой промьппленности, также при получении синтетических моющих средств с ферментными добавками, также в медицине и животноводстве.

Цель изобретения — получение нового штамма — продуцента липазы, об

„„SU„„1454852 А 1 (58 4 C 12 N 9/20//(С 12 N 9/20, С 12 R 1:645) высокой липолитической активностью и широкой субстратной специфичностью.

Изобретение заключается в том, что путем многоэтапной селекции адаптивным методом получен штамм дрожжей

Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А. — активный продуцент липазы. Высокая липолитическая активность штамма и способность его усваивать различные субстраты обеспечивается питательной средой следующего состава, мас.7.: этанол 0,29-0,62; кукурузное масло

0,1-0,5; аммоний сернокислый 0,25-;

0,04; магний сернокислый 0,05 — .

0,09; натрий хлористый 0,02-0,06; кальций углекислый 0,08-0,5; калий фосфорнокислый однозамещенный О,11, О; калий фосфорнокислый двуэамещенный 0,01-0,15; дрожжевой экстракт

0,01-0,02, вода водопроводная остальное. На новой среде штамм обеспечивает липолитическую активность 75008000 ЛЕ/мл, стабилен в пределах рН

4-9,5 и температуры 28-45 С. 2 с.п.

Ф-лы, 4 ил, 1 табл, 2 ладающего при культивировании на новой среде повышенной липолитической .активностью с расширением субстратной специфичности синтезируемого им фермента.

Пель изобретения достигается тем, что в качестве продуцента липазы используют штамм дрожжей Jarro "ia lipolytica 739. Штамм получен многоэтапной селекцией адаптивным методом на сусло-агаре и среде Ридер с последующим выделением активных вариантов, )454852

Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов ВНИИ антибиотиков под 9 304А.

Штамм дрожжей Jarrowia lipolytica

ВНИИА 304А отличается следующими морфологическими и физиологическими признаками.

Морфология. На среде Чапека рост умеренный. На вторые сутки клетки округлые, овальные и удлиненные размером (2,5-5) х (3-)5) мкм. Размножение почкованием. Иногда наблюдается образование псевдомицелия. Колонии бесцветные или желтоватые до коричневатых. Образование спор не наблюдается.

Культуральные признаки. На жидком сусле на вторые сутки роста наблюдается помутнение среды, образование 20 небольшого осадка и пристенного кольца, утончающегося к центру.

На сусло-агаре на вторые сутки рост культуры обильный, складчатый.

Образуется хорошо развитый истинный 25 мицелий с бластоспорами, обычно опущенный по краям. Колонии имеют

Б-форму. При длительном хранении культуры беэ пересевов в популяции накапливаются клетки„ образующие ко- 30 лонии )1.-формы.

Физиологические признаки. Культура использует следующие источники углерода: глюкозу, галактоэу, мальтозу, лактоэу, сахарозу, этанол, глицерин, лактат, сукцинат, цитрат. .В качестве источника азота использусреды. Влияние концентрации этанола в среде на образование липазы представлено на фиг. 1.

При изучении влияния некоторых растительных масел, жиров, синтетических триглицеридов и олеиновой кислоты, взятых в различных концентрациях, на образование липазы куль1Q турой Jarrowia lipolytica ВНИИА

304А при выращивании ее на среде с

5 мл/л этанола установлено, что в присутствии кукурузного масла в питательной среде в количестве 0,2%

15 интенсивность накопления липазы возрастает на 37% (таблица и фиг. 2).

50

55 ют соли алюминия.

Нитраты не усваивает.

Желатину не разжижает.

Молоко пептонизирует.

Оптимальный рост в диапазоне температуры 26-37 С, рН 7,5-8,0.

Культура поддерживается на суслоагаре беэ снижения активности в течение 2 мес. Пересев 1 раз в 2 мес.

Для выявления оптимального источника углерода культуру выращивают на среде Ридер, содержащей 0,5% глккозы. Заменяя глюкозу другими источниками углерода, установлено, что экономически выгодно в качестве источника углерода использовать этанол — более дешевый и недефицитный источник углерода. Концентрация этанола, оптимальная для образования липазы,. составляет 3-6,5 мл/л среды. Максимальное накопление липаэы наблюдается при концентрации этанола 5 мл/л

Таким образом, питательная среда для культивирования штамма дрояокей

Jarrowia lipolytica ВНИИА 304A — продуцента липаэы имеет следующий состав: этанол в качестве источника углерода, минеральные соли (аммоний сернокислый, магний сернокислый, натрий хлористый, кальций углекислый, калий углекислый, калий фосфорнокислый однозамещенный и калий фосфорнокислый двузамещенный), дрожжевой экстракт и кукурузное масло в качестве стимулятора роста и активатора накопления липаэы при следующем соотношении компонентов среды, мас.%:

Этанол 0,29-0,62

Кукурузное масло 0,1 -0,5

Аммоний сернокислый 0,25-0,4

Магний сернокислый 0,05-0,09

Натрий хлористый 0,02-0,06

Кальций углекислый 0,08-0,5

° )(алий фосфорнокислый одноэамещенный 0,1 -1,0

Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,01-0,15

Дрожжевой экстракт 0,01-0,02

Вода водопроводная Остальное

Примеры использования культуры

Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А и питательной среды для ее культивирования.

Пример 1. Посевной материал культуры дрожжей Лаггоьна lipolytica

ВНИИА 304А выращивают на среде следующего состава, мас.%:

Этанол 0,38

Аммоний сернокислый 0,3

Магний сернокислый 0,07

Натрий хлористый 0,05

Кальций углекислый О,1

1454852

Калий фосфорнокислый одноэамещенный 1,0

Калий фосфорнокислый двуэамещенный О,l

Дрожжевой автолизат 0,1

Вода водопроводная 97,9

Среду, кроме этанола, разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют при

1,0 атм в течение 30 мин, После охлаждения среды к ней в стерильных условиях добавляют по 0,38 г (0,5 мл

96Х-ного) этанола в каждую колбу, Для засева посевных колб используют двухсуточную культуру, выращенную на косяках сусло"агара или агара

Ридер. Культуру смывают с косяков стерильной водой и в каждую колбу вносят по 5 мл суспенэии. Посевной материал выращивают в течение 24 ч при 240-250 об/мин и 26-30 С.

В основную ферментацию вносят посевной материал в количестве 5% от объема среды, Для основной ферментации готовят питательную среду следукщего состава, мас.%:

Этанол 0,38

Кукурузное масло 0,2

Аммоний сернокислый 0,3

Магний сернокислый 0,07

Натрий хлористый 0,05

Кальций углекислый 0,1

Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,0

Калий фосфорнокислый двуэамещенный О,l

Дрожжевой экстракт 0,01

Вода водопроводная 97,79

Приготовленную среду, кроме этанола, стерилизуют при 1,2 атм в течение 60 мин. После охлаждения к среде в стерильных условиях добавляют эта.нол.

Ферментацию с целью получения липолитического фермента проводят в опытно-промьппленном ферментаторе емкостью 100 л при коэффициенте заполнения 0,7. Температура ферментации

26-28 С, РН 7,5-8,0 РС2 на уровне

40-45Х .от максимального насыщения.

За 18 ч процесса в культуральной жидкости накапливается липолитический фермент 8000 ЛЕ/мл (эа ЛЕ принимают такое количество фермента, которое в стандартных условиях в течение 1 ч освобождает 1 мкмоль жирных кислот).

0,1

0,5

Биомассу от культуральной жидкости отделяют центрифугированием. Отделенную биомассу используют для получения дрожжевого автолизата и возвращают в среду для выращиваний йосевного материала. Осветленную жи {кость высушивают в распылительной сушилке при температуре входящего

10 теплоносителя 180 С, выходящего-7v С; о,о

Получают препарат с липолитической активностью 235 ЛЕ/мг, выход по активности 93Х. Препарат может быть использован в меховой, в легкой промышленности и в животноводстве.

Пример 2. Выращивание посевного материала проводят аналогично примеру 1. Для основной ферментации готовят питательнук среду следу-

20 ющего состава, мас.%.:

Этанол 0,42

Кукурузное масло 0,1

Аммоний сернокислый 0,4

Магний сернокислый 0,09

Натрий хлористый 0,04

Кальций углекислый 0,2

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Калий фосфорнокислый двуэамещенный 0,01

Дрожжевой экстракт 0,01

Вода водопроводная 98,63

Условия культивирования аналогичны примеру I при отличии, что процесс

36 проводят при дифференцированном Режиме аэрации. в течение первых 6 ч ферментации поддерживают рО на уровне 60-65Х от максимального насыщения, от 6 до 12 ч на уровне 40-45%, от

40 12 ч до конца ферментации на уровне

20-25% от максимального насыщения.

В течение 18 ч ферментации в куль" туральной жидкости накапливается липолитический фермент 7700 ЛЕ/мл.

4Б Последующая обработка и использование аналогичны примеру 1.

- Пример 3. Выращивание посевного материала проводят аналогично примеру 1. Для основной ферментации

60 готовят питательную среду следующего состава, мас.Х:

Этанол 0,31

Кукурузное масло 0,2

Аммоний сернокислый 0,25

Магний сернокислый 0 05

Натрий хлористый 0,06

Кальций углекислый 0,3

Калий фосфорнокислый одноэамещенный

14548

40

55

Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,05

Дрожжевой экстракт 0,02

Вода водопроводная 98,26

; Условия ферментации аналогичны

Ьримеру 1.

3е 18 ч ферментации в культураль" ной жидкости накапливается лицолитический фермент 7500 ЛЕ/мл. Последук-, 1О щая обработка и использование аналогичны примеру 1.

Пример 4. Выращивание посев-, ного материала проводят аналогично примеру 1. 15

Для основной ферментации готовят питательную среду следующего состава, мас.7:

Этанол 0,62

Кукурузное масло 0,5

Аммоний сернокислый 0,4

Магний сернокислый 0,09

Натрий хлористый 0,06

Кальций углекислый 0,5

Калий фосфорнокислый

25 однозамещенный 1,0

Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,15

Дрожжевой экстракт 0,02

Вода водопроводная 96,66

Условия ферментации аналогичны примеру 2.

3а 18 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается липолитический фермент 7600 ЛЕ/мл. Последующая обработка и использование аналогичны примеру 1, Пример 5. Выращивание посевного материала проводят аналогично примеру 1.

Для основной ферментации готовят питательную среду следующего состава, Mac ego s

Этанол 0,29

Кукурузное масло 0,3

Аммоний сернокислый 0,25

Магний сернокислый 0,06

Натрий хлористый 0,02

Кальций углекислый . 0,08

Калий фосфорнокислый 50 однозамещенный 1,0

Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,10

Дрожжевой экстракт 0,0!

Вода водопроводная 97, 89

Условия ферментации аналогичны примеру !.

За 18 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается липолити52 8 ческий фермент 7500 ЛЕ!мл. Последующая обработка и использование аналогичны примеру 1.

Субстратную специфичность липазных препаратов культуры Jarrowia

lipolytica ВНИИА 304А проверяют следующим образом.

Готовят реакционную смесь: к

2,5 мл 40Х-ной эмульсии исследуемого субстрата (различные масла, жиры, глицериды) в 2Й-ном поливиниловом спирте добавляют 0,5 мл раствора фермента, 2,5 мл фосфатного буфера (рН 7,8) и выдерживают в течение

1 ч при 37 С. Реакцию прекращают о добавлением 10 мл смеси этанол:ацетон (.1:1), титруют 0,05 н, гидроокисью натрия. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое при 37 С в течение 1 ч освоd бождает I мкмоль жирной кислоты. Относительную активность определяют по отношению к расщеплению оливкового масла.

Липаза культуры Jarrowia lipol.ótica ВНИИА 304А отличается расширенным спектром действия, расщепляет субстраты, содержащие глицериды с длиной молекулы жирных кислот в 16-!

8 атомов углерода, Это является важной предпосылкой для использования липазы в меховой промышленности.

Ниже приведена субстратная специфичность липаэных препаратов культуры Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А:

Субстрат Липазная активность, 7 к оливковому маслу

Оливковое масло 1ОО,О

Подсолнечное масло 1!7,6

Кукурузное масло 126,9

Горчичное масло 48,5

Соевое масло 48,1

Касторовое масло 52,3

Хлопковое масло 65,3

Рыбин жир 74,0

Свиной жир 79,0

Трибутирин 72,7

Область стабильности препарата находится в пределах рН реакционной смеси 4-9,5 (фиг. 3), температуры реакционной смеси 28-45 С (фиг. 4), Эффективность использования штамма Jarrowia lipolytica ВНИИА 304А и питательной среды для ere культивирования обеспечивается высокой липолитической активностью препарата

9 14548 (7500-8000 ЛЕ/мл), расширением его субстратной специфичности к различным маслам, стабильностью активности в широких пределах рН (4-9,5) и темпе- ратуры (28-45 С).

Формула изобретения

1. Штамм дрожжей Jarrowia 1ipoly- 1п

tica ВНИИА 304А - продуцент липазы.

2. Питательная среда для культивирования штамма дрожжей Jarrowia

lipolytica ВНИИА 304А - продуцента липазы, содержащая источники углерода, сернокислый аммоний, фосфорнокислый двузамещенный калий, стимулятор роста и воду, о т л и ч а ю щ а яс я тем, что, с целью повышения ли-. политической активности продуцента 20 и расширения.субстратной специфичности синтезируемого им фермента, среда содержит в качестве источника

0,29-0,62

0,1 -0,5

0,25-0,4

0,05-0,09

0,02-0,06

0,08-0,5

0,1 -1,0

0,01-0,15

0,01-0,02

Остальное

Липолитическая активность, Х к контролю, при количестве добавки, Х

Добавка (О 0,05

0,1

100 97 92

Оливковое масло

100 97

65 50

35

Соевое масло

56 48

94

Подсолнечное масло 100 94

90

66 45

127 123

90

100 91

137

100 103 131

86

97

68

85

77

86

42

77

72

88

65

Касторовое масло

Кукурузное масло

Горчичное масло

Рыбий жир

Кашалотный жир

Трибутирин

) Триолеин, Олеиновая кислота

100 99

100 95

100 91

100 80

100 97

100 93

52 l0 углерода этанол и кукурузное масло, в качестве стимулятора роста - дрожжевой экстракт, а также дополнительно содержит сернокислый магний хлористый натрий, углекислый кальций и фосфорнокислый однозамещенный калий при следующем соотношении компонентов, мас.Х: .1

Этанол

Кукурузное масло

Сернокислый аммоний

Сернокислый магний

Хлористый натрий

Углекислый кальций

Фосфорнокислый однозамещенный калий

Фосфориокислый pay" замещенный калий

Дрожжевой экстракт

Водопроводная вода

02 ." " L 20

Т

84 64 44 35! 454852

ЖЮ ив

l500

9 В 8 .: ...-,, Зоамю,юл/д

Curl

k 7000 л

° < N6 ф

255No

Ь

01 О 2 05 1 ануя)ррное масло Ф срей, % сРиа.2

1454852

0(z) 5 9 5 6 7 0 9 10 рн

Фиг-Ю

Я t

Составитель Е. Воробьева

Техред М. Хода нич Корректор,С. Яекмар

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 7411/30

Тираж 500

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ухгород, ул. Проектная, 4

ВНК4ПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5