Штамм культивируемых клеток почки sаigататаriса, для вирусологических исследований

 

Изобретение относится к области биологии, а именно к цитологии и представляет собой новую перевиваеыую клеточную линию почки сайги, испольэуемуот в ветеринарной вирусоло-- гни для вьаделения и идентификации вирусов, ретроспективной диагностики, а также приготовления диагностических и вакцинных препаратов. Целью изобретения является линия клеток почки сайги (ПС), способности расти на несложной по составу и недорого- f стоящей питательной среде. Линию клеток ПС выращивают на несложной по составу питательной среде, состоящей из 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина на солевом растворе Эрла с добавлением 10%-ной ннактивированной сыворотки крупного рогатого скота, рН 7,2 - 7,5. Клетки пересеваются с коэффициентом 1:2, 1:3, выращивают в стационарных и роллерных условиях. Со стекла снимают 0,02г-ным раствором версена,подогретого до 37 С, с добавлением 0,25%-ного трипсина. По морфологическим признакам клетки ПС состоят преимущественно из удлиненных полигональных клеток с округлыми сравнительно мелкими ядрами. Клетки ПС обладают стабильным кариотипом и имеют модальный класс 48 хромосом, что составляет 32%. Линия клеток ПС чувствительна к многим вирусам - возбудителям болезней с.х.животных, в том числе и к вирусу диареи,везикулярному стоматиту, оспе коров, оспе лошадей и другим. Вирусы вызывают цитопатические изменения с поражением 90-100% монослоя клеток на 2-6 дни культивирования. } табл. (Л 4 О со ел а

„,SU„„1463756 А 1

СОЮЗ СОИ ЕТОНИХ социалистичасних

РЕСЙУБЛИН д) С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

OP%

APH ГННТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и АВТОРСЙОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 4092085/30- 13 (22) 18.07.8б (46) 07.03.89.Ввл. И 9 (71) Научно-исследовательский сельскохозяйстзеннмй институт Госагропро-.: ма СССР (72) Л.П.Кнрюхина, И.Г.Кекух, Л.П.Демченко и С.Г.Стусь (53) 578.085.23 (088.8) (5б) Новохатский А.С. и др. Каталог перевивавмах клеточных линий, И., т.1 1-б, 1980.

Сейбиль В.В. н др. Актуальные проблемы вирусах инфекций. И., 1959. (54) ЩАМИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ SAXGA ТАТАКЕСА ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ (57) Изобретение относится к области биологии, а именно к цитологии и представляет собой новую перевиваемую клеточную линию почки сайги, используемую в ветеринарной вирусоло-.. гии для выделения и идентификации вирусов, ретроспективной диагностики, а также приготовления диагностических н вакцинных препаратов. Целью изобретения является линия клеток почки сайги (ПС 1, способности расти

Изобретение относится к биологии, а именно к цитологии, и представляет собой новую перевиваемую клеточную линию почки сайги, используемую в ветеринарной вирусологии для выделения и идентификации виру- . сов» .ретроспективной диагностики, на несложной по составу и недорого- р стоящей питательной среде. Линию клеток ПС выращивают на несложной по составу питательной среде, состоящей из 0,5Х-ного раствора гидролизата лактальбумина на солевом растворе Эрла с добавлением 1ОХ-ной инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, рН 7,2—

7,5. Клетки пересеваются с коэффициентом 1:2, 1:3, выращивают в стационарных и роллерных условиях ° Со стекла снимают 0 02Х-ным раствором версена,подогретого до 37 С, с добавлением 0,25Х-ного трипсина. По морфологическим признакам клетки ПС состоят преимущественно из удлиненных полигональных клеток с округлыми сравнительно мелкими ядрами. Клетки

ПС обладают стабильным кариотипом и имеют модальный класс 48 хромосом, что составляет 32Х. Линия клеток ПС чувствительна к многим вирусам— В®иа возбудителям болезней с.х.животных, фЬ в том числе и к вирусу диареи,вези- фф кулярному стоматиту, оспе коров, « Ю оспе лошадей и другим. Вирусы вызывают цитопатические изменения с по- «» ражением 90-100Х монослоя клеток на

2-6 дни культивирования. 1 табл. а также приготовления диагностических и вакуумных препаратов.

Целью изобретения является получение новой перевиваемой клеточной линии почки Saiga tatarica (сайги), способной расти на несложной по своему составу и недорогостоящей пита—

1463756 т льной среде, и чувствительной к в русам-возбудителям болезней сельсхозяйственных животных, увеличивая тим набор перевиваемых клеточных иний диких животных1 чувствительных .к вирусам.

Полученная перевиваемая клеточная г1иния почки сайги (ПС) хранится в коллекции BCKK СХЖ под номером 23, ймеет следующие морфологическую и ультуральную характеристики.

Эпителиальные клетки удлиненные, олигональной формы с четко вираенными границами, с округлыми сравительно мелкими ядрами с 3-5 ядрьпп1 ами. Кариоплазма интерфазных ядер етчатая, нежно-волокнистая с выраенной фунгицидной активностью в ядьппках (просветленная центральная она, разрыхленная структура), Питолазма клеток светлая, не вакуолизиована. Клетки гетероплоидные с варьрованием числа хромосом от 32 до

7 обладают стабильным кариотипом и меют модальный класс 48 хромоом, что составляет 32Х .

При сравнительном изучении ферментативной активности установлено, что клетки имеют низкую активность кислой и щелочной фосфотаз и высокую сукцинатдегидрогеназную актив.ность. Гликоген имеет. форму мелких ,зерен.

При пересеве клетки быстро прикрепляются к стеклу и в усповиях стационарного и роллерного культивирования образуют колонии округлой формы с ровными краями. Максимум митотической активности приходится на 3-и сутки культивирования и составляет 40-45Х.

При посевной дозе клеток 10 /мл сплошной монослой формируется в матрасах, флаконах и пробирках на 23-и сутки культивирования.

Формирование клеточного монослоя возможно и при пересеве 1:6,1:8, при этом монослой образуется на 5-7-е сутки культивирования.

Клетки снимают со стекла 0,02%ным раствором версена, подогретого до 37 (25 ч.), с добавлением 0,25Х трипсина (1 "«.). При этом предварительно старую питательную среду удаляют, клеточный монослой промывают раствором Хенкса и в сосуд добавляют версен с трипсином в укаэанном соотношении, Сосуды оставляют в термостате при 37 С на 5-10 мин. После разобщения клеток монослоя (наблюдение ведут визуально или с помощью микроскопа) сосуды осторожно перево5 рачивают так, чтобы слить версен с трипсином, не касаясь клеток ° Затем в сосуды вносят большое количество питательной среды и энергично встряхивают для снятия клеток и получения однородной суспензии.

Культуру клеток ПС выращивают на питательной среде, состоящей из

0,5Х гидролизата лактальбумина на солевом растворе Эрла с добавлением

10Х -инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, рН 7,2-7,5.

Клетки неприхотливы к питательным средам и хорошо растут также

2О на среде 199, среде Игла.

Хранения культуры клеток ПС.

Монослой клеток в условиях термоста та при 37 С сохраняется в течение месяца без смены среды, со сменой

25 среды через каждые 5-7 дней — в течение трех месяцев; при комнатной температуре (18-22 С) — в течение о

20 дней и в суспензии при 4-6 С вЂ” до

6 сут.

30 Для длительного хранения применяют метод замораживания клеток в жидком азоте при -196 С. Криозащитной средой при этом является среда культивирования (70Х) с добавлением

10Х диметилсульфоксида и 20Х натив35 ной сыворотки крупного рогатого скота. Замороженную культуру хранят в сосудах Дьюара, заполненных жидким азотом.

4р Чувствительность к вирусам. Перевиваемая линия клеток ПС чувствительна к ряду вирусов — возбудителей болезней с/х животных, в том числе к вирусу диареи, везикулярному стоматиту, 4r оспе коров, оспе лошадей и другим.

Вирусы вызывают выраженные цитопатические изменения с поражением 80100Х монослоя клеток на 2-6 дни кульTHBHPoBRHHH, При исследовании не обнаружено микоплазм, бактерий и грибов .

Контроль контаминации латентными вирусами проводят с помощью электронной микроскопии.

В качестве исходного материала используют первичные культуры клеток почек сайгн. Трипсинизацию проводят по общепринятой методике. Для выращивания первичной культуры исполь1463756 зуют 0,57-ный гидрализат лактальбумина (ГЛА) на солевой основе среды

Хенкса с добавлением 107 сыворотки сологии методике. Учет результатов заражения проводят через 2-6 дней по наличию цитопатического действия вируса (ЦПД) в инфицированных культурах и отсутствию ЦПД вируса в контрольных (незараженных) культурах °

Результаты заражения представлены в таблице.

Вируссодержащий материал

Цитопатическая активность (в 1g

ЦД50/мл ) Поражение монослоя клеток,7

5,0-6,0!

Диарея

Везикулярный стоматит

Осла коров

Оспа лошадей

5,0-6,0

5,5-6,0

5,0-6,0

Иэ представленных данных видно, что клеточная линия почки сайги способна поддерживать размножение вирусов диареи, везикулярного стоматита, оспы коров и оспы лошадей с проявлением хорошо выраженного цитопатического действия и поражением 90-100Х монослоя и способна накапливать вирусы от 5,0 до 6,0 1g

T U1 f0/мл

Формулаизобретения

Штамм культивируемых клеток почки Saiga tatarica ВСКК (СХЖ) Р 23, для вирусологических исследований., Составитель И.Тареева

Техред Л.Олийнык Корректор О.Кравцова

I!

Редактор Г.Волкова

Заказ 790/31 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101 крупного рогатого скота, пенициллина — 100 ед./мл и стрептомицина по 100 мкг/мл. Трипсинизированные клетки засевают в матрасы (500000 кл/

/мл) и выращивают в условиях термостата при 37 С. Смену среды прово- 10 дят через 3 дня, полный монослой фор-.. мируется на 6-7-е сутки, Первичные культуры подвергают длительному субкультивированию. При пересеве клетки снимают со стекла 0,02Х-ным 15 раствором версена (25 ч.), подогретого до 37 С с добавлением 0,25Х трипсина (1 ч) ..B качестве питательной среды используют 0,57. ГЛА на солевом растворе Эрла с добавлением 20

107-ной сыворотки -.крупного рогатого скота, рН 7,2-7,5. Субкультура кле ток ПС в первых 10-20 пассажах при посевной концентрации 500000-600000 кл./мл формирует полный мо25 нослой на 7-12-е сутки. Срок формирования монослоя постоянно сокращается и к 50-60 пассажам составляет

5-7 дней. По мере пассирования клеток ПС происходит постепенное замещение фибробластоподобных клеток на эпителиоподобные и усиливается их пролиферативная активность. Сроки . формирования монослоя при коэффициенте пересева 1:2, 1:3 составляют 35

2-3 дня. К 80-пассажному уровню пролиферативная активность стабилизируется.

Пример. Для подтверждения чувствительности ПС к вирусам диареи, 40 веэикулярного стоматита, оспе коров и оспе лошадей используют культу-. ральные вируссодержащие материалы с предварительно определенной цитопати- ф ческой RKTHBHocTbN ° Пробирочные культуры клеток ПС заражают дозой вируса

10 Т1К,> „„ по общеприятой в виру