Штамм гибридных культивируемых клеток животных rаттus norvegicus,используемый для получения моноклональных антител к гликопротеиду базальных мембран ламинину

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в диагностике опухолевых заболеваний. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животньк-Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к нативному ламинину, работающие в радиоиммунологическом тесте. Штамм получают гибридизацией сплено- ; цитов крысы, иммунизированной клетками мышиной тератобласТОМЫ, с клетками миеломы X63-Ag8.653. Продукция МКА на 5-й день культивирования составляет 5-10 мкг/мл. МКА относятся к классу IgGi-(H). Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран ламинином (двумя его цепями мол.м. 200 и 350-400 кД). Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% змбриональной телячьей сьшоротки, модальное число хромосом в клетках штамма 81. с SS С/)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (П) (51) 4 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4263697/28-13 (22) 18. 06. 87 (46) 30. 01. 89. Бюл. ))- 4 (7!) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР (72) А.В. Любимов, С.М. Трояновский, Л.В. Литвинова, В.М. Сенин и А.В. Афанасьева (53) 578.085.23(088.8) (56) Lab. Invest, 1984, v, 51, р. 88; (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ RATTUS NORVEGICUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОHAJIbHbIX AHTHTEJI К ГЛИКОПРОТЕИДУ БА-

ЗАЛЬНЫХ MENBPAH ЛАМИН11НУ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в диагностике опухолевых заболеваний.

Целью изобретения является получение.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в диагностике онкологических заболевании .

Цель изобретения — получение штам- 5 ма гиб ридных куль тив ируемых клеток животных Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к нативному ламинину, работающие в

10 радиоиммунологическом тесте.

Штамм получают следующим образом.

В качестве антигена используют монослойную культуру клеток мышиной тератоблас томы ТБ 3, суспендированную в забуференном физрастворе (ЗФР) с помощью мягкой резинки. Схема иммунизации: крысы линии Фишер получают

4 внутрибрюшинные инъекции по 2-3 штамма гибридных культивируемых клеток животных- Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (MKA) к нативному ламинину, работающие в радиоиммунологическом тесте.

Штамм получают гибридизацией сплено ", цитов крысы, иммунизированной клетками мышиной тератобластомы, с клетками миеломы Х63 Ag8.653. Продукция МКА на 5-й день культивирования составляет 5-10 мкг/мл. МКА относятся к клас— су IgG +,(Н). Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран ламинином (двумя его цепями мол;м. 200 и 350-400 кД). Штамм культивируют на среде Игла в модификации с

Дульбекко с 20Х эмбриональной телячьей сыворотки, модальное число хромосом в клетках штамма 81.

Ва

«1,0 клеток каждая, первая — в равном объеме полного адъюванта Фрейнда, последующие — в равном объеме неполного адъюванта. После первой инъекции следующую проводят через 3 не- О© дели, остальные — через 10-дневные ЯЛ интервалы. Последняя инъекция — внутривенно, в переднюю камеру глаза, без адъюванта, в объеме 0,2 мл (5-я иммунизация) .Гибридизацию проводят на 4 день после 5-й иммунизации. Для этого клетки селезенки )ммунных крыс (10 ) гибридизуют с 5 10 клеток мы— шиной миеломы X63-Ag 8.653 с помощью

50Х-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 1500. Культивирование гибридных клеток ведут в 96-луночных

))латах на предварительно посаженных ! з 1454851

4 перитонеальных макрофагах мыши (5"8 Характеристика полезного продукта. .й10 клеток на лунку) ° Питательная МКА относится к классу IgQ 3",(Н) ° среда: среда Игла в модификации Дуль- Специфичность - гликопротеиц бабекко (ДМЕМ) с 20Х эмбриональной те- зальных мембран ламинин. Антитела лячвей сыворотки или lOX эмбриональ- реагируют с тканями мыши, кролика, . 5 ной телячьей сыворотки и 10Х лошади- хомяка, человека, Метод оценки сохра.ной сыворотки, I мМ пирувата, 10 М нения специфичности: иммуиофлуоресгипоксантина, 4»10 М аминоптерина. ценция (окрашиваются баэальные меми l,бе!0". M тимидина, 100 ед/мл гент- 1р браны на срезах) и радиоиммунопреци.амицина. Гибридомы клонируют 2 раза, . питация:, антитела связывают с сефавысевая на лунку с макрофагами по розой с пришитыми иммуноглобулинами

1 клетке. Отбор клонов осуществляют кролика или козы против иммуноглобуиммунофлуоресцантным окрашиванием линов крысы, инкубируют с меченным культур ° клеток ТБ 3 и криостатных 15 аминокислотами или I лиэатом мыИ4 срезов почки мыши. Иэ 700 проверенных шиной тератобластомы ТБ-24 или мыши. лунок с гибридомами культуральная ной опухоли EHS, преципитат подвергажидкость (КЖ) одной из них реагирует ют электрофореэу в присутствии додев. иммунофлуоресценции с культурами цилсульфата натрия {в градиентном

ТБ Э (фибриллярное свечение) и ба-, 2p полиакриламидном геле 5-15Х), высуэальньмн мембранами ночки мыши, хомя- шейный гель подвергают авторадиограка, кролика и человека, а в радиоим- . фии. Положительная реакция проявляетмунонреципитационном тесте - с целым ся присутствием на автографах двух ламинином (мол. массы 400 кД + меченых полос, соответствующих цепям

+ 200 кД). Полученный клон выводят. -26 ламииина 200 и 350-400 кД. в массовую культуру и обозначают ЛАМ. . Контаминация. Бактерии и грибы

Штамм хранится в:Специализированной . в культуре не обнаружены при длительколлекции перевиваемых соматических ном наблюдении и посевах на питательклеток позвоночных Всесоюзной кол- ные среды. лекции клеточных культур (институт Зп Криоконсервирование. Клетки-штамцитологии AH СССР) под.номером . ма ресуспеидируют в эмбриональной теBCKK (IX) 1!i .125D и характеризуется льячей сыворотке, содержащей 10 диследующими признаками. метилсульфоксида, в концентрации 1-4». . »1О кл. в I мл, разливают в стериль- .

Культуральные признаки. Среда . ные пластиковые ампулы при 4 С и закультивирования - среда Игла в моди- .. мораживают в жидком азоте по програмфикации Дульбекко (ДМЕМ) с 20Х;эм- . :. ме со .снижением температуры на бриональной телячьей сыворотки (или - 1 С/мин с последующим переносом в

10Х эмбриональной телячьей .сыворотки жидкий азот. Размораживание: 1 .мин и 10Х лошадиной сыворотки),,l . мМ . 4p при 37 С;Клетки разводят в 5-10 млпол-. глутамина,,l 00 ед. гентамицина, в .. .ной среды,центрифугируют при комнатной ..l. мл. Клетки выращивают при 37 С... температуре 5 мин при !000 об/мин, ш 5Х углекислоты э атмосфере. Для вы-. сливают среду; заливают 2 мл свежей, ращивания штамма .можно использовать среды и переносят в 2 лунки 24-луночстеклянную ипи пластиковую посуду.. 45 ной платы с предварительно посаженВо флакон объемом 25 см в 5 мл сре" . . ными перитонеальными макрофагами мыды засевают 2-5»!О клеток ЛАМ. Пас" .ши (25-40»10, клеток на лунку). ЖизЭ саж - l раэ в 4-5 дней той же дозой: неспособность клеток по включению клеток, Bes подсчета клеток 1 Э.: трипаиового. синего составляет 50-90Х.

Культивирование in vivo. Так как П р,и м е р 1. Кусочки почки, погибридома получена при слиянии клетьк лученной от свежезабитой мыши или крысы и.мыши, культивирование: in что от 16-20- недельного эмбриона человека в обычных животных невозможно. при выкидыше, помещают в 7Х-ный расКариологические .признаки. Модаль- твор желатина на ЗФР и немедленно ное число хромосом-8!. Продуктивность 56 эамораживают в жидком азоте. лохи штамма. Секрецйя моноклональных анти- хранят при -70 С. Срезы толщиной тел на 5 день культивирования в 1 мл .5 мкм готовят на криотоме, фиксируют

5-10 мкг..Стабильная продукция МКА 5 мин в 10Х-ном формалине на ЗФР и сохраняется до 30 пассажей ьп ч1его. тщательно отмывают в ЗФР, Далее ста5 145485! вят реакцию непрямой иммунофлуорес- патин молочной железы человека. Кусоценции при комнатной температуре. чек ткани молочной железы, удаленный

Ilepsast инкубация 1 ч - КЖ клеток при биопсии, заливают в желатин и заштамма JIAM. После отмывки в ЗФР вто- мораживают не позднее 1 ч после опе.рая инкубация - кроличья антисыворот- рации. далее материал обрабатывают, 5. ка к иммуноглобулинам крысы, мечен- как указано в примере 1. На cpese ная флуоресцеинизотиоцианатом в раэ- отмечают положительную реакцию с баведении 1.;20 после предварительного зальньми мембранами пролифератов. истощения сыворотки печеночным порош-10 Эпителиальные и стромальные клетки ком мьппи. Инкубация 1 ч, затем отмыв- не окрашены. Следовательно, ламинин ка в ЗФР. Срезы заключают в глицерин содержится только в составе базальных на ЗФР (1:)), Контроль — первая инкУ-, мембран. Непрерывный характер окрашибация с ЗФР вместо МКА., вания баэальных .мембран указывает на

Препарат исследуют в микроскопе 16 доброкачественную природу опухоли. с флуоресцентной приставкой, отмечают свечение базальных мембран почки. Приведенный пример подтверждает

При этом в клубочках почки мьппи гло- воэможность использования полученных мерулярные базальные мембраны слабо МКА для диагностики опухолевых забоокрашены, в клубочках почки челове-, 20 леванкй человека. ка - нет. Клетки канальцев, эндотелий сосудов, строма не. окрашены, сле- Ф о р м у л а и s о б р е т е н и я довательно, не содержат ламинина.

Таким образом, полученные МКА специ- Штамм гибридных культивируемых фически выявляют гликоцротеид базаль- 26 клеток mwoxasnc Rattus norvegicus ныхмембранламинининевзаимодействуют ВСКК (II) !! 1259, используемый для с другими белками кле тки. .. получения моноклональных антител к .

Пример 2. Иммунолокализация . гликопротеиду базальных мембран лаламинина в фиброзно-кистоэной масто- минину.

-г

1 Составитель М. Серова

Редактор Н, Киштулинец Техред M.Коданнч . Корректор С. Шекмар

О

Заказ 7411/30, Тираж 500 . . . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

ЮЮ

Производственно;полиграфическое предприятие, г. Ужгород, уп. Проектная, 4