Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к мембранному белку еsснеriснiа coli в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки рекомбинантного интерлейкина-2 человека. Целью изобретения является получение гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцирующих моноклональные антитела (МК) к мембранному белку Е. со11 4 кВ, содержащемуся в препарате части.чно очищенного рекомбинантного интерлейкина-2 (Р1-Ш-2) человека. Штамм получают гибрвдизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных РИЛ-2 человека с клетками миеломы ХбЗ- -Ag8-653. Секреция МКА на 2-3 день культивирования составляет 35- 40 мкг/мл культуральной среды и 10- 15 мг/мл асцитической жидкости. МКА относятся к классу IgGi. Они специфически взаимодействуют с мембранным белком Е. coli м.м. 4кВ. Содержание примесного белка Е. coli после очистки РИЛ-2 на сорбенте, содержащем полученные МКА, составляет 15%. 1 табл. Ф

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК 191 + (ll) (51) 4 С 12 К 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABT0PCKO5hY СНИДЕТЕЛЬС ГВУ фь Ъ

ЯТ

«

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4251939/28-13 (22) 28.05.87 (46) 23.12.88, Бюл. Р 47 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови (72) А.В. Панютич, Н.Н. Войтенок, А.Ю. Циманис, Ю.П. Бундулис и В.А, Скривелис (53) 578.085.23(088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК NHBOTHbK Ш$ MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕИЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К МЕМБРАННОМУ БЕЛКУ

ESCHERICHIA C0LI В ПРЕПАРАТЕ РЕКОМБИНАНТЕ10ГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки рекомбинантного интерлейкина-2 человека. Целью изобретения является получение штам1ка гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к мембранному белку Е. cali 4 кР, содержащему-ся в препарате частично очищенного рекомбинантного интерлейкина-2 (РИЛ-2) человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Ва1Ъ/c, иммунизированных РИЛ-2 человека, с клетками миеломы Х63-Ag8-653. Секреция МКА на 2-3 день культивирования составляет 3540 мкг/мл культуральной среды и 10l5 мг/мл асцитической жидкости. NKA относятся к классу IgGi. Они специфически взаимодействуют с мембранным белком Е. cali м.м. 4к0. Содержание примесного белка Е. coli после очистки РИЛ-2 на сорбенте, содержащем полученные МКА, составляет 157..

1 табл, 1.446157

Культуральные признаки. Среда культивирования — среда МДМ с 10i . донорской телячьей сыворотки, 2 мМ

L-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ а меркаптоэтанола, при 37 С и в атмосфере 57. СО .

Изобретепие относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки рекомбинантного интерлейкина-2 (РИЛ-2) человека.

Целью изобретения является полф5 чения штамма гибридных культивируемых клеток животных Nus musculus> продуцирующего мопоклональные антитела (МКА) к мембранному белку

Е. со11 м.м. 4 KD > э агряз няющему препараты РИЛ-2, Штамм получают следующим образом..

Мышей линии Ваl Ь/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД

РИЛ-2 человека в 0,15 мл 0,15 М !!аС1 в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Иммунизации повторяют 3 раза через 14 дней тем же

/ количеством антигена в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. За 3 дня до слияния РИЛ-2 вводят внутрибрюшинно в 0 5 мл 0,15 М NaC1. ГибридизаЪ цию 1 10 клеток селезенки иммунных т мышей и 3 10 клеток миеломы мыши 25

Х63-Ag8-653 проводят 507-ным раствором полиэтиленгликоля мол.массы

4000, содержащего 57 диметилсульфоксида, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывки от полиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луноч5 ные панели по 1 ° 10 спленоцитов в лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду IМДМ (модифицированная Iskove s среда

Дульбекко) с добавлением 107 эмбри35 опальной телячьей сыворотки (ЭТС), 10 М гипоксантина, 4- 10 М аминоп-4 терииа и 1,6 10 М тимидина. Гибри-5 ды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по

1 клетке в лунку, содержащую 4 10 клеток селезенки. После 2 клонирова— ний практически 1007 субклонов продуцируют МКА к антигену Е, coli.

Полученный штамм обозначают

29Б1,2, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных под номером

ВСКК (Q) 110 D и характеризуется сле50 дующими признаками.

Для выращивания штамма используют стеклянную посуду; посевная доза

200 тыс. клеток на I мл, клетки пассируют один раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:6-1:8 °

Культура суспензионная.

Культивирование в организме животных..Для выращивания асцита пригодны мыши Ва1Ь/с. -Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана ° Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 10

6 клеток в I мл среды 1МДМ. Асцит формимируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 2-3 день культивирования составляет 35-40 мкг в мл культуральной среды и 10-15 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полезного продукта.

Штамм продуцирует моноклональные антитела изотипа IgGI. Специфичность— мембранный пептид Е. coli с мол.массой 4000, содержащийся в препарате

РИЛ-2 человека, Методы оценки сохранения специфичности: тест на связыва" ние МКА с иммобилизованным частично очищенным РИЛ-2 (иммуноферментный анализ), Продукция МКА сохраняется как минимум до 10 пассажей in vitro. В асцитной форме штамм не пассируется более одного раза, Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплаэмой не выявлено по характеру включения тимидиновой метки.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10 диметилсульфоксида. Режим замораживания:

1 С в 1 мин до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот, Размораживание — на водяной бане при +37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 40-507 по окрашиванию трипановым синим.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон

6 объемом 50 мп bio 1 10 клеток в

5 мл среды с 107. ЭТС, 2 MM L-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола (МЭ). Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 57 СО . Полу57

4 и нередуцирующие условия), и эквивалентное количество лизата Е. coli в буфере для образца с МЭ прогревают

2 мин при 100 С и наносят в ячейки геля. Электрофорез осуществляют при постоянной силе тока 50 мА.

Электроперенос разделенных компо" нентов из геля на нитроцеллюлозу (НЦ) с диаметром пор 0,45 мкм проводят н течение 1 ч. После перекоса

НЦ промывают дистиллированной водой и дацее обрабатывают с помощью набора для иммуноблотинга. Неспецифическую сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС1 буфере рН 7,4 с

0,5 М ИаС1 (ТБР), содержащем 3% желатины. После этого НЦ промывают

2 раза ТБР с 0,05% твин-20 (ТТБР) и разрезают на полоски. Полоски, соответствую@не ДСН-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирующих условиях и лиэата E. coli, помещают н стеклянные пробирки емкостью 15 мл и добавляют 10 мл супернатанта МКА

29Б1.2.

Инкубацию с МКА продолжают 2 ч при 20 С на аппарате с горизонтальным перемешиванием. После этого НЦ отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, добавляют козьи антимышиные антитела, разведенные 1/2000 н ПЕР, 1% БСА и инкубируют 1 ч при 20 С с перемешивакием. После 2 отмывок ТТБР и одной отмывки ТБР реакцию проявляют в растворе субстрата, содержащем 4-хлор-1-нафтол и 0,015% И О н течение

20 мин. Для хранения и фотогрйфиронаI ния НЦ промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Результаты исследований свидетельствуют о взаимодействии полученных антител с мембранным белком Е. coli м.м 4к0, содержащимся в препарате

5 частично очищенного РИЛ-2 человека.

Электрофоторетическая подвижность белка Е. со11 при ДСН-ПААГЭ одинакова в редуцирующих и нередуцирующих условиях. Полученные МКА используют для очистки РИЛ-2 человека. Содержание примесного белка Е. cali после очистки РИЛ-2 на сорбенте, содержащем полученные МКА, составляет 15%.

3 14461 ченный супернатант используют в качестве реагента в.иммунохимических реакциях (как препарат МКА), Антигены высушивают в лунках

96-ячеечных микроплат при 37 С или о

20 С в следуюцих количествах: частично очиценный РИЛ-2 — 150 нг в 20 мкл бидистиллированной воды; мембранная фракция, растворимые белки Е. cali и бычий сывороточный альбумин (БСА) по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной воды. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штамма 29Б1.2. Панель инкубируют 2 ч при 20 С, затем отьывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по

50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченые пероксидазой, раз веденной 1/2500 в О,OI М фосфатном буфере, рН 7,4, .0,15 М ИаС1, 1%. БСА (ЗФР-BCA). После инкубации в течение

1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки добавляют субстрат — ортофенилендиамин гидрохлорид (0,6 мг/мл) в 26 цитратно-фосфатном буфере рН 4,7, содержащем 0,03% 11 0 . Реакцию останавливают через 10 мин 1- M серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм, Результаты исследований представлены в таблице.

Антигены

РИЛ-2, час- тично очиценный

Растворимые белки E.coli

Мембранная фракция

Е. coli

БСА

2083

420

1141

2I8

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о высокой спе-., цифичности полученных МКА к мембранному белку Е. coli.

Пример 2. Электрофорез в

15% -ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГЭ) проводят с использовани55 ем аппарата для вертикального элект рофореза. РИЛ-2 в количестве IO мкг в буфере для образца, содержащем или не содержащем МЭ (редуцирующие

Культуральная среда штамма 29БI 2 А492 10

Формула иэ обр ет ения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (П)Я110 D, используемый для получеСоставитель М. Серова

Редактор Н. Гунько Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор Г, Решетник

Заказ 7566

Тираж 520

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1446157 6 ния моноклональных антител к мембран-, парате рекомбина»тного интерлейки" ному белку Escherichia col i в нре- »а-2 человека.