Штамм гибридных культивируемых клеток животных мus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к 1g а человека и высших обезьян

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики рака носо глотки. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирую1дих моноклональные антитела (ММ) к общей антигенной детерминанте IgA человека и высших обезьян. Штамм получают гибри- .цизацией спленоцитов мьшей линии BALB/C, иммз -низированных секреторным IgA человека, склетками миеломы X63-Ag8.653. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 10 мкг/ /мл, в асцитической - 10 мкг/мл. МКА относятся к классу IgG, они направлены к тяжелой цепи IgA человека - и высших обезьян. МКА преципитируют IgA человека в присутствии полиэтиленгликоля м.м. 6000. Константа ассоциации МКА с IgA человека составляет 2,2. М, с IgA обезьян - 5ЧО м,

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (g))g С 12 N 5/00 А 61 К 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4268527/28-13 (22) 15.04.87 (46) 30.01.90. Бюл. N- 4 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии АМН СССР (72) И.Н.Клоц, А.Ф.Воеводин, И.Г.Зоделава, Т.Э.Оганян и Е.Н.Размадзе (53) 578.085.23(088.8) (56) Европейский патент Р 0161638, кл. С 12 Р 21 /00, 1985. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬ"

НЫХ АНТИТЕЛ К IgA ЧЕЛОВЕКА И ВЫСШИХ

ОБЕЗЬЯН (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики рака носоглотки.

Цель изобретения — получение штам ма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела (MKA) к общей антигенной детерминанте IgA человека и высших обезьян.

Штамм получают следующим образом.

Спленоциты мьппей линии Ва1Ь/с, имму-. низированных секреторным IgA человека, сливают с клетками миеломы Х63Ag 8.653 с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000.

Селекцию клонов ведут на среде

ГАТ. Клон, имеющий равную реактив„„Я0„„146О994 А 1

2 для диагностики рака носоглотки.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых кле-. ток животных, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к общей антигенной детерминанте IgA человека и высших обезьян. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии

HALB/ñ, иммунизированных секреторным

IgA человека, с-клетками миеломы

Х63-Ая8.653. Концентрация MKA в культуральной жидкости составляет 10 мкг/

/мл, в асцитнческой — 10 мкг/мл.

МКА относятся к классу IgG, они направлены к тяжелой цепи IgA человека . и высших обезьян. МКА преципитируют

IgA человека в присутствии полиэтиленгликоля м.м. 6000. Константа ассоциации МКА с IgA человека составляет

2,2 ° 10 7 М, с IgA обезьян — 5 10 М. ность с IgA человека и высших обезьян, выводят в массовую культуру и обозначают А . Штамм А хранится в

Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером ВСКК/П/ 89D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Стандартные условия выращивания: среда RPMI-1640+15Х сыворотки плода

0 коровы, 37 С; газовая фаза — воздух +

+ 5% СОа.

Клетки культивируют в стеклянных или пластиковых флаконах на 50

250 мл, посевная доза — 500000 кл/мл;

1460994 кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня.

Характеристика культивирования гибридомы в организме животного: мыши Ва1Ь/с, обработанные пристаном

5 (1 мл в/б за 10 дней до инокуляции), доза инокуляции — 5-10 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

Продуктивность штамма. 10

Концентрация полезного продукта в культуральной среде около 10 мкг/мл, в асцитной жидкостй — около

10 мкг/мл,титры данных антител при определении с помощью твердофазного иммуноферментного метода около 10 (среда) и 1О (асцит) при концентрации антигена 1 мкг/мл. Определение

МКА проводят также иммунофлюоресцентными и радиоиммунологическими 20 методами. Продукция моноклональных антител стабильна по крайней мере в течение 10 пассажей in vitro.

Характеристика полезного продукта. 25

МКА относятся к классу IgG, они направлены к тяжелой цепи ХяА человека и высших обезьян.

МКА преципитируют IgA человека в присутствии ПЭГ-6000 (реакция встречной и радиальной иммунодиффузии). Константа ассоциации NKA c

IgA человека составляет 2,2 10 М, с IgA обезьян — 5 ° 10 1 N.

Контаминация.

Бактерии, грибы и микоплазмы .отсутствуют. Родительская линия Х63-Ag

8.653 продуцирует эндогенный ретровирус С-типа мышей.

Криоконсервирование.

5-6 млн. кл. замораживают в жидком азоте в присутствии 90% сыворотки плода коровы и IOX DMSO. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 903 (по включению трипанового синего).

Использование штамма иллюстрируется следующими поимерами.

Пример 1.

Навески иммуноглобулинов всех классов человека в количестве 15 мкг

50 на трек кипятят в течение 5 мин на водяной бане в буфере для нанесения, содержашем меркаптоэтанол. При этом происходит разрушение дисульфидных связей и при электрофорезе иммуноглобулины разделяются на составляющие их тяжелые и легкие цепи. Электрофореэ выполняется в двух параллельных образцах. Половина геля окрашивается красителем Кумасси голубым для визуализации белковых цепей, из другой половины геля белки элюируют электропереносом на лист нитроцеллюлозы, которая обладает способностью сорбировать белки за счет физической адсорбции. Полученный лист нитроцеллюлозы или "блот " блокируют в растворе 8%-ного сухого обезжиренного молока для блокирования всех свободных адсорбционно активных точек нитроцеллюлозы. Блот инкубируют 2 ч при 37 С о с культуральной жидкостью, содержащей МКА, отмывают от несвязавшихся

ИКА и инкубируют 2 ч при 37 С с антимьгииным пероксидазным конъюгатом, который связывается с МКА. После отмывки несвязавшегося конъюгата блок инкубируют с раствором диаминобенэидина. Пероксидаза в присутствии перекиси водорода переводит диаминобензидин в окрашенное соединение. В результате на блоте появляются окра- шенные полосы только в тех местах, где ИКА взаимодействуют со своим антигеном, в данном случае — тяжелыми цепями IgA. Результаты исследований свидетельствуют о высокой специфичности полученных МКА к тяжелым цепям

IgA человека и высших обезьян.

Пример 2. Клетки, продуцир вЂ, ющие Эпштейн-Барр-подобный вирус (ЭБВ), фиксируют на стеклах для иммунофлюоресцентного анализа. В точке, где находятся фиксировайные клетки, добавляют каплю сыворотки больного или здорового донора,. После инкубации о при 37 С в течение 1 ч стекла промывают для удаления несвязавшихся антител. Стекла далее инкубируют с разведением МКА, продуцируемых штаммом

А, в течение 1 ч при 37 С ° После отмывки стекла инкубируют с антимышинным конъюгатом ФИТЦ-антитело (флюоресцеин-изотиоцианат) с последующей отмывкой для удалениянесвяэавшегося конъюгата. Те сыворотки, которые содержат IgA к ЕБВ, при просмотре стекол в УФ излучении под микроскопом демонстрируют зеленую иммунофлюоресценцию, Число флюоресцирующих клеток и интенсивность окраски пропорциональны содержанию антител в сыворотке больных раком носоглотки.

Всего исследовано .25 сывороток больных раком носоглотки и 50 сыво1460994

Составитель М.Серова

Редактор Н.Козлова Техред Л.Сердюкова Корректор Т.Палий

Заказ 157 Тираж 498 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина,101 роток здоровых доноров, У всех больных раком носоглотки с помощью МКА четко идентифицируют IgA против ЭБР, в то время как положителыых результатов не получают с сыворотками здоровых доноров. Таким образом, полученные MKA можно эффективно использовать для диагностики рака носоглотки по наличию сывороточного антиЭБВ

IgA.

Формула изобретения

Штамм гибридных культквируемых клеток живстных Hus musculus ВСКК (П) N89D, используемый для получения моноклональных антител к IgA человека и высших обезьян.