Штамм культивируемых клеток крысы,используемый для получения гормона роста человека
Изобретение относится к биотех-. нологии и может быть использовано для получения медицинских препаратов гормона роста человека. Целью изобретения является повышение уровня сингормона роста человека пео . Штамм клеток депонирован в теза гормона роста человека. Штамм получают заражением клеток Rat-1 рекомбинантным ретровирусн.ым вектором, полученньм на основе вектора pPS-I- пео и несущим ген предшественника (hGH) и ген Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 136Д. Штамм ВСКК(П) 136Ц гормон роста человека синтезирует до 1000 нг/мл культуральной среды, обладает высокой и стабильной продукцией , высокой пролиферативной активностью и простотой культивирования. I табл. (С
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСНОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4268093/31-13 . (22) 26. 06. 87 (46) 30. 01 . 89. Бюл. 4
{71) Институт молекулярной биологии
АН СССР (72) В.С. Прасолов, П.М. Рубцов, С.М. Серов, К.Г. Скрябин и П М.Чумаков (53) 578.085.3(088.8) (56) Cell 1982, v. 29, р. 623-631 ° (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК КРЫСЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотех-. нологии и может быть использовано для получения медицинских препаратов гормона роста человека. Целью изобретения является повышение уровня син1
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового клеточного штамма, продуцирующего гормон роста человека, культуральная среда клеток Rat-hGH 14 может быть использована для получения медицинских препаратов гормона роста человека.
Цель изобретения — повьппение уров,— ня синтеза гормона роста человека.
В клетки линии Rat-1 вводят ген предшественника гормона роста человека с помощью ретровирусного вектора
pPS-1-пео.
Пример 1. Штамм получают следующим образом.
Исходные клетки Rat-1 при субконфлюентной плотности заражают рекомбинантным ретровирусным вектором, полученным на основе вектора pPS-1-пео
„.я0„„1454853 И
yg 4 С- 12 N 15/00, С 12 N 5/00 теэа гормона роста человека.. !!!тамм получают заражением клеток Rat-1 рекомбинантным ретровирусным вектором, полученным на основе вектора pPS-l— пео и несущим ген предшественника гормона роста человека (hGH) и ген к
neo . Штамм клеток депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных
Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 136Д, Штамм ВСКК(П) 136Д гормон роста человека синтезирует до 1000 нг/мл культуральной среды, обладает высокой и стабильной продукцией, высокой пролиферативной активностью и простотой культивирования. Q
I табл.
2 и несущим ген предшественника гормона роста человека (МН) и ген пео
При этом засевают 2 10 клеток Rat-1 на пластиковые чашки диаметром 1 00 мм, 5 культивируют 1 сут при 37 С, с 57. о
СО в ростовой среде МЕМ или ДМЕМ с 507 сыворотки новорожденных телят. .
На следующий день ростовую среду удаляют и на клетки наносят 10 мл вирус.содержащей среды с 6 мкг/мл полибрена. Инкубируют клетки с вирусом 2 ч о при 37 С, с 5Е С0, эатем среду заменяют на обычную ростовую. Через 1 сут в ростовую среду вводят антибиотик
G418 в концентрации 500 мкг/мл. Селекция клеток, включивших в свой геном ген пео, продолжается 12-16 дней. В результате селекции получают культуру генетически трансформирован— ных клеток Rat-hGH, устойчивых к ан4853 4
55 з 145 тибиотику G418 и продуцирующих в среду hGH. Далее культуру клеток "RathGH клонируют в ячейках 96-луночных планшетов и наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру.
Штамм клеток депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером
ВСКК(П) 136Д.
Штамм ВСКК(П) 136Д характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. На фиксированных и окрашенных препаратах штамма Rat-hGH14 культура представлена монослоем однородных вытянутых фибробластных клеток с овальными ядрами, содержащими мелкие ядрышки.
Морфология клеток культуры остается неизменной за все время культивирования и характерной для исходных клеток
Rat-1. Таким образом, генетическая трансформация клеток Rat-hGH14 не привела к морфологическим изменениям.
Культуральные свойства. Штамм
ВСКК(П) 136Д поддерживают на минимальной среде Игла (МЕМ) или среде
Игла в модификации Дальбекко (ЦМЕМ) с 57 сыворотки новорожденных телят в виде монослойной культуры. Отделение клеток от стекла или пластика проводят 0,25 -ным раствором трипсина. Коэффициент рассева 1:7-1:10.
Посевная доза 3 10 -5 10 клеток на
500 мл флакон Повицкой. Среднее время удвоения 36 ч. Плотного монослоя культура достигает к четвертому дню после пассажа. Для клеток характерно контактное ингибирование, присущее исходным клеткам Rat-1. При достижении монослоя клеточные деления прекращаются и в таком состоянии культура может сохраняться неделями при комнатной температуре.
Криоконсервация. Для криоконсервации применяют MFM или ДМЕМ с 20% сыворотки новорожденных телят и 77 диметилсульфоксица в качестве криопротектора. Концентрация клеток составляет 2-3 10 на 1 мл. Жизнеспособными после восстановления остаются
7525% клеток.
Кариологическая характеристика.
Кариологический анализ штамма ВСКК(П)
136Д проводят на уровне 20-ro пассажа. Подсчитывают хромосомы в 200 метафазных пластинках. Разброс хромосомн» х чисел колеблется в пределах 32!
О
46 хромосом, т,е. большая часть популяции клеток представлена клетками с околодиплоидным числом хромосом.
Выявлено два модальных класса клеток с 42 хромосомами (347) (2n=42 для крысы) и 40 хромосомами,327) . Дифференциальной окраски хромосом не проводят, маркерных хромосом не выявлено.
Контроль штамма Rat-hGH14 на контаминацию. При обследовании клеток штамма на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) были получены отрицательные результаты на уровнях 11, 20 и 3! пассажей.
Устойчивость к антибиотикам. В результате генетической трансформации штамм приобрел устойчивость к антибиотику неомицинового ряда G418 (до
500 мкг/мл ростовой среды).
Продукция гормона роста человека штаммом ВСКК(П) 136Д. Продукцию гормона роста человека клетками ВСКК(П)
136Д тестируют методом радиоиммуно— преципитации и .RIA с использованием кроличьей поликлональной сыворотки к
hGH. Для определения hGH методом RIA используют коммерческие наборы реагентов для определения hGH в сыворотке.
Иммунная сыворотка преципитирует из культуральной среды полипептид с молекулярной массой 22 Kd-hGH. Только небольшая часть синтезируемого этими клетками hGH остается внутри клеток, основная же его масса находится в культуральной среде. Таким образом, клетки штамма осуществляют нормальный синтез, процессинг и секрецию гормона роста человека.
Использование штамма BCKK Пример 2. Динамика накопления гормона роста человека в культуре клеток. Х Клетки засевают в количестве 3 ° 10 в 10 мл МЕМ + 5 сыворотки новорожденных телят»a чашки Петри диаметром о 100 мм (Жпс) и культивируют при 37 С во влажной атмосфере с 57 СО . Каждые 12 ч проводят отбор проб культуральной среды из двух параллельных чашек (по 1 мл среды), аликвоты объединяют и используют для определения концентрации hGH методом RIA. В качестве контроля используют исходные клетки Ка1;-l, засеянные с ана5 !454853 б логичной плотностью и культивируемые в Результаты определения представлеаналогичных условиях.,ны в таблице. « е««« «« Время после засева, сут т- » т 1 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 Штамм 0,5 Rat-1 (контроль) 50 50 60 50 50 50 50 60 50 50 50 50 Rat-hGH 14 (опыт) 1 50 70 90 120 250 450 480 500 800 1000 1100 1100 Составитель Т. Забойкина Редактор Н, Киштулинец Техред M.Ходанич Корректор С. Шекмар Заказ 7411/30 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета.по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Концентрация гормона роста представлена в нанограммах на миллилитр культуральной среды. Как видно иэ данных таблицы, максимальная продукция hGH клетками штамма Rat-hGH14 достигается на пятые сутки культивирования и составляет 1000 нг/мл культуральной среды, при 1 этом стабильная продукция ЬСН наблюдается на протяжении 35 пассажей (3-4 мес, срок наблюдения). 20Формула изобретения Штамм культивируемых клеток крысы ВСКК (П) 136Д, используемый для получения гормона роста человека. 
