Штамм гибридных культивируемых клеток животных мus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к j @ g человека и высших обезьян

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 4 50 А1 (51) 4 С 12 N 5/00, А 61 К 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медико-биологических исследованиях.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток 5 животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА), обладающие равной реактивностью с

IgG человека и высших обезьян.

Штамм получают следующим образом.

Спленоциты мышей линии BALB/c иммунизированных IS- -глобулином человека, гибридизуют с клетками миеломы Х63-Ag8.653 с помощью полиэтилен15 гликоля (ПЭГ) м,м. 6000. Селекцию клонов ведут на среде ГАТ. Клон, имеющий равную реактивность с IgG

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

l1O ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГГИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4270378/28-13 (22) 15.04,87 (46) 30.01.89. Бюл. N 4 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и терапии AMH СССР (72) Е.Н. Размадзе, А.Ф. Воеводин, И.Н, Клоц, И.Г. Зоделава и Т.Э.Оганян (53) 578.085.23(088.8) (56) Европейский патент Р 0163141, кл. С 12 P 21/00, 1985. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

KJIET0K )KHB0THblX MUS hfUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ?8С ЧЕЛОВЕКА И ВЫСШИХ

ОБЕЗЬЯН (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медико-биологических исследованиях, .

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (MKA), обладающие равной реактивностью с ?ЕС человека и высших обезьян.

Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/с, им, упиэированных IS-3"-глобулином человека, с клетками миеломы Х63-Ag8.653. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 10 мкг/мл, в асцитической — 10 мг/мл. MKA относятся к классу ТяСд„, они направлены против класс-специфической детерминанты константного региона тяжелых цепей IgG человека и высших обезьян. МКА пре" ципитируют IgG человека и высших обезьян в присутствии полиэтиленглпколя м.м. 6000.

I вД человека и высших обезьян, выводят д в массовую. культуру и обозначают С . р

Штамм G хранится в Специализирован- о

3 ной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института

Цитологии АН СССР под номером

ВСКК(Щ 90Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия выращивания — среда

RP".Ï-1640+15X сыворотки плода коровы, 37 С, газовая фаза — воздух +5% СО .

Клетки культивируют в стеклянных или пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза — 500000 кл./мл; крат ность рассева 1."2, время субкультивирования 3-4 дня.

4850

35 вносят разведения каждой из 10 взятых сывороток человека и шимпан40 зе. При этом белки, находящиеся в

4 сыворотках, собирают на пластике лунок. Лунки промывают для удаления несвязавшихся белков: свободные адсорбционные точки лунок блокируют

45 8Х-ным раствором сухого обезжиренного молока, после чего в лунки вносят либо разведения 1КА 1:5000, либо поликлональные антитела, меченные пероксидазой, реагирующие с тяжелыми о

50 цепями IgG. После инкубации при 37 С в течение 1 ч лунки промывают для удаления несвязавшихся антител. Затем в лунки вносят антимышиный пероксидазный конъюгат и панели инкубируют о в течение 2 ч при 37 С. После отмывки в лунки добавляют раствор о-фенилендиамина, который пероксидаза в присутствии перекиси водорода превраща— ет в окрашенное соединение. Степень з

Характеристика культивирования в организме животного: мьппи линии

BALB/с, обработанные простаном (1 мл, внутрибрюшинно за 10 дней до инокуляции), доза инокуляции 5-10 млн, кл., время образования асцита 10-20 дней. . Продуктивность штамма, Концентрация полезного вещества в культуральной среде составляет около 10 мкг/мл, в асцитной жидкости около 10 мг/мл.

Титры MKA при определении с помощью твердофазного иммуноферментного метода: 2 ° 10 (культуральная среда) и

10 (асцит) при концентрации антигена 1 мкг/мл. Продукция MKA стабильна, по крайней мере, в течение .10 пассажей in vitro. Характеристика полезного продукта:MKA относятся к классу IgGg, они направлены против класс-специфической детерминанты константного региона тяжелых цепей IgG человека и высших обезьян; специфичность оценивается иммуноферментным, радиоиммунологическим и модифицированными иммунодиффузионными методами.

MKA преципитируют IgG человека и высших обезьян в присутствии ПЭГ-6000 (реакция встречной и радиальной иммунадиффузии). Контаминация. Бактерии, грибы и микоплазмы отсутствуют. Родительская линия Х63-Ag.8.653 продуцирует эндогенный ретровирус С вЂ” типа мьппей. Криоконсервирование. 56 млн. кл. замораживают в жидком азоте в присутствии 90Х сыворотки плода коровы и 10Х ЭМБО. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90Х (по включению трипанового синего).

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Навески иммуноглобулинов всех классов человека в количестве 15 мкг на трек кипятят в течение 5 мин на водяной бане в буфере для нанесения, содержащем меркаптоэтанол. При этом происходит разруше— ние дисульфидных связей молекул,и они разделяются в виде единичных полипептидных цепей. Образцы исследуют в двойном количестве параллельно на одном и том .ке геле. Одну половину геля окрашивают с помощью красителя

Кумасси голубого, который окрашивает все белковые полосы, присутствующие в геле. Из второй половины геля белковые полосы переносят на листы нитроцеллюлозы с помощью электропереноса. Нитроцеллюлоэа обладает способностью удерживать белки на своей поверхности за счет сил физической адсорбции. Нитроцеллюлозу,или так называемый блот,инкубируют в 8Х-ном растворе обезжиренного сухого молока для блокирования всех незаполненных адсорбционных точек. Затем блот инкубируют в течение 2 ч при 37 С в разведении асцитной жидкости 1:100.

После отмывки для удаления несвязавшихся МКА блот инкубируют с меченным пероксидазой конъюгатом против мышиных иммуноглобулинов в течение 2 ч при 37 С. Блот отмывают, иммуноопределяемые полосы визуализируют обработкой с субстратом — диаминобензидином.

Конъюгат в присутствии перекиси водорода превращает диаминобензидин в окрашенное соединение. Только те белко— вые полосы, которые взаимодействуют с НКА, становятся видны на блотах.

Результаты исследований свидетельствуют о высокой специфичности полученных ЯКА к тяжелым цепям IgG человека и высших обезьян.

Пример 2. ИКА, продуцируемые гибридомой С, используют для определения уровня IgG в сыворотках человека и шимпанзе, взятых в разведении

1; 1000, методом твердофазного иммуноферментного анализа. Параллельно те же сыворотки тестируют с использова— нием поликлональной антисыворотки, направленной к тяжелым цепям ?8С человека. В лунки 96-луночкой панели

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK(II)

У 90Д, используемый для получения моноклональных антител к IgG человека и высших обезьян.

Составитель М. Серова

Редактор Н. Киштулинец Техред М. Ходанич Корректор С. Шекмар

Заказ 7411/30 Тираж 500 Подписное л вс

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1454850 6 окраски при 492 нм (A y> ) пропорцио= шимпанзе, но и к детерминантам, присутнальна концентрации IgG в сыворотке ствующим только íà IgG человека. человека и обезьян. Коэффициенты кор- Таким образом, МКА обеспечивают реляции вычисляют с помощью соответ- более эффективное тестирование общей

5 ствующей программы на ЭВМ, антигенной детерминанты IgG человека

Коэффициент корреляции между дан- и высших обезьян. ными, полученными с помощью МКА и поликлональной антисыворотки для чело- Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я веческого IgG. равен 0,96, для IgG шимпанзе — 0,91. Это отражает тот факт, что поликлональная антисыворотка содержит антитела не только к детерминантам, общим для человека и