Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к легумину бобовых

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекционной работе для выведения высокопродуктивных сортов бобовых культур. Цепью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к П S легумину бобовых. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мьшей линии BALB/C, иммунизированных легумином бобовых, с клетками мнеломы SP 2/0 Ag 14-5. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 100 мкг/мл, в асцитной 5-6 мг/мя. МКА относятся к классу IgG. Они специфически реагируют с легумином (С-концевой частью субъединицы , локализованной на кислых полипептидах легумина). Минимально определяемые концентрации легумина в семенах бобовых составляют 0,003- 0,16 мкг/Мл. 1 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕа1УЬЛИН

„,Я0„„1458384 А1 (51)4 С 12 Н 5 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЭОБРНТНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ CCCP (21 ) 4229788/28-13 .(22) 28,04,87 (46 } 15.02.89. Бюл. Ф 6 (71) Институт прикладной молекулярной биологии и МГУ им. М.В,Ломоносова (72) С.Е.Северин, Т.В.Буларгина, В.A.Ôóðàëåâ, П.Г.Свешников, : Ю;Ю.Венгеров и Е.С.Северин (53) 578.085.23{088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS МУБСШПБ, HCIIOJIb""

ЗУЕМЬй ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОЙАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К ЛЕГУМИНУ БОБОВЫХ . .(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекционной работе для выведения высокопродуктивных сортов бобовых

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекционной работе для выведения высокопродуктивных сортов бобовых культурЦелью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus продуцирующего моноклональные антитела (MKA) к 11 S легумину бобовых.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/С иммунизируют трехкратно путем внутрибрюшинной инъекции высокоочищенного легумина (по 100 мкг на каждую инъекцию с интервалом в 15 суток). Через три дня после последней инъекции клетки се-: лезенки сливают с клетками миеломы культур. Целью изобретения является получение штамма гибридных культиви руемых клеток животных Mus musculus продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к 11 Б легумину бобовых.

Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/С, иммунизированных легумином бобовых, с клетками миеломы Sp 2/О Ag 14-5. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 100 мкг/мл, в асцитной

5-6 мг/ма. МКА относятся к классу

IgG. Они специфически реагируют с легумином (С-концевой частью субъедиHHIIbl локализованнбй на кислых полипептидах легумина). Минимально определяемые концентрации легумина в семенах бобовых составляют 0,0030,16 мкг/мл. 1 табл.

ЪФ

twas

Бр 2/О Ац 14-5 в соотношении 10:1. В >фью качестве гибридизующего агента используют полиэтиленгликоль М.М. 4000 QQ (время выдержки при слиянии 5 мин).

Отбор клонов ведут на селективной среде ГАТ. Первое тестирование позитивных клонов осуществляют через 2 недели после слияния, затем позитивные клоны реклонируют в полужидком агаре и затем второй раз методом предельных разведений. Наиболее продуктивныи клон выводят в массовую культуру и обозначают 1Н9 Бр 2/О. Штамм 1Н9

Sp 2/О хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером 131 D и характеризуется следующими признаками.

1458384

Культуральные признаки.

К моменту паспортизации и депонирования число пассажей штамма 1Н9

Бр 2/О составляет 60 в культуре.и 25 на животных, Среда культивирования: среда Дульбекко с 15% сыворотки эмбриона коровы, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ

-меркаптозтанола, 50 мкг/мл гентамицина или 100 ед/мл пенициллина и

100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют в атмосфере воздуха с

,7,5% СО при 37 С. Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату клеток. Характер роста - стационарная суспензия. Время удвоения популяции 48 ч, частота пассирования — через 2-3 суток, кратность рассева—

1/2"1/3, посевная концентрация клеток

1-2 10 кл/мл.

Введение клеток штамма в брюшную полость мышей линии BAI,B/С вызывает у них образование асцитных опухолей.

Доза клеток для введения животным

,.2-10 10 . 3а 1-2 недели до введения клеток мышей сенсибилизируют внутри брюшинной инъекцией,0,3-0,5 мл мине,рального масла нристана (2, 4, 10, . !4-тетраметилпентадекана).Время образования асцитных опухолей 10-16, суток, на протяжении 25 пассажей на, блюдают 90% образования асцитов беэ

,изменения титров антител.Продуктивность штамма.

Титр моноклональных антител опре, деляют непрямым иммуноферментным ме, тодом, он составляет 1:!000 для культуральных жидкостей и !".10 для асцитных жидкостей, концентрация моноклональных антител в культуре100 мкг/мл,.в асцитной жидкости— около 5-6 мг/мл. !!!тамм продуцирует MKA в течение

60 пассажей в культуре и 25 на животных.

Характеристика полезного продукта.

МКА относятся к классу IgG. Они специфически реагируют с легумином (С-концевой частью субъединицы, локализованной на кислых полипептидах легумина).

Контаминация. Бактерии, грибы, дрожжи и микоплаэмы не обнаружены.

Криоконсервирование.

Культуральная среда с 30% эмбри| ональной сыворотки коровы и 10% диметилсульфоксида (криопротектор), ампулы с клетками охлаждают до -70 С

5 !

О

ЗО

50 со скоростью 1 град/мин, ампулы хранят при температуре жидкого азота, размораживание осуществляют, поыещая ампулы в водяную баню с 37 C жизнеспособность составляет 50% после размораживания (определяют по окрашиванию трипановым синим).

II р и м е р. Клетки клонов 1Н9

Бр 2/О вводят в брюшную полость 3 мьппам линии BAIB/С. Предварительно за 7 суток мьппей иммунизируют введением внутрибрюшинно 0,5 мл пристана.

Каждой мыши вводят 2 ° 10 клеток в

0,5 мл фосфатного буфера. Асцитные жидкости отбирают в стерильных yñëîвиях на 16 день после инъекции. Количество асцитной жидкости составляет 2 5; 4 и 6 мл соответственно.

Клетки отделяют цеитрифугированием в конических пробирках при 800 g в течение Я мин и используют для инъекций мышам следующей партии. Моноклональные антитела иэ асцитных жидкостей получают путем 3-кратного осаждения, сульфатом аммония при концентрации 40% от насыщения с последующим диалиэом против Na,K-фосфатного буфера рН 7,5 с добавлением 0,1 М

NaC1, При необходимости используют иммуноаффинную хроматографию на белке А.Степень очистки иммуноглобулинов по данным электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия составляет около 90%.

Моноклональные антитела используют для определения содержания легумина и легуминподобных глобулинов в семенах бобовых: горох, нут, клевер, люцерна„ карагана, лядвенец, соя, фасоль, люпин, для чего получают белковые экстракты из муки сумян зкстрак" цией 0,5 M ИаС1 при 4 С в течение ночи. Глобулины выделяют при насьпцении экстрактов сернокислым аммонием до концентрации 3,9 M и диализом осадка против дистиллированной воды в течение ночи. Легумин и легуминподобные глобулины отделяют от вицилина (7 8 глобулин), зонным осаждением на сефадексе. Твердофазное иммуно- ферментное определение легумина в экстрактах осуществляется по схеме

"Сэндвич", для чего моноклональные антитела, продуцируемые штаммом 1Н9

$р 2/О сорбируют на 96-луночные планшеты иэ HHvpoIJåëëþëàçû, внося по 100 мкл раствора антител с концен-

5 1458384, трацией 20 мкг/мл в 0,1 М трисглициновом буфере рН 8,7 в лунку и инкубируют при 4 С в течение ночи. Затем планшеты промывают 3 раза 0,15 М фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением .

0,015 М твина-20 и вносят легумин сои и других бобовых культур, указанных вьппе, в концентрациях 0,00350 мкг/мл в 0,15 М фосфатном буфере рН 7,2 с добавлением 0,015 М твина-20 и 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) и инкубируют 1 ч при

37 С.

Планшеты промывают 5 раз 0,15 М фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением 0,05 М твина-20 и вносят моноклональные антитела, меченные пероксидазой, Пероксидаэную метку вводят в моноклональные антитела периодат- 20 ным методом, После инкубации в течение

I ч при 37 С лунки промывают 5 раз фосфатным буфером с твин-20 и вносят по 100 мкл раствора субстрата (водный раствор ортодианизидина с концентра- 25 цией 0,25 Mr/ìë) в фосфатно-цитратном Кармана буфере. Через 30 мин реакцию останав ливают добавлением 50 мкл 4 М серной кислоты. Оптическую плотность измеряют при длине волны 405 нм. 30

Результаты исследований представлены в таблице.

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что минимально определяемые концентрации 35 легумина в семенах бобовых составляют величины 0,003-0,16 мкг/мл. формула и з о б р е т е н и я

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus niusculus BCKK(II) 40

М 131 D, используемый для получения моноклональных антител к легумину бобовых.

Продолжение таблицы

0,08

0,64

2,0

1,33

1 45

0,003

0,006

0,016

0,18

0,25

0,35

0,4

1,17

1,45

1,58

0,003

0,016

0 28

0,36

0,08

0,58

2,0

0,67

0,15

0,14

0,003

0,08

0,2

0,33

0,38

45

0,43

Вид культу ры центрация умина в экс кте, мкг/мл

О, 00 3

0,016

Бобы

0,10

0,32

Определение содержания легумина в семенах бобовых культур с помощью моноклональных антител к легумину

"Значения оптических плотностей Й

50 отрицательном контроле составляют

0,05 + 0,05, значения оптических плотностей вицилина этих культур в концентрациях по крайней мере до 10мкг/мл не отличаются от значений отрицатель-, 55 ного контроля.