Способ получения изолированных клеток печени

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.SUÄÄ 1463757 А 1

15@ 4 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Я И .ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС ГИУ (21) 4221432/31" 13 (22) 02.04.87 (46) 07.03.89. Бюл. I« 9 (71) Институт проблем криобиологии и криомеднцины АН УССР (72) Л.Н Кравченко, А.Н. Андриенко, О,А. Семенченко, А.N. Петренко и А.Н. Сукач (53) 578.085.23 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1310426, кле С 12 N 5/00, 1985.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине, Целью изобретения является повышение функциональной активности изолированных клеток печени.

П р и и е р I. Перфузию печени животных весом 200-250 r проводят

in situ. Для этого вскрывают брюшную полость анестезированных животных, вводят инъекционную иглу в воротную вену и закрепляют лигатурой,а нижнюю полую вену надсекают в месте ответвления правой почечной вены для оттока перфузата. На первом этапе отмывку печени от крови проводят раствором Локка (рН 7,6) в течение 1015 мин при температуре раствора 37 С

Состав раствора Локка, г/л:

Хлористый натрий 9,00

Хлористый калий 0,42 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЬП(.

КЛЕТОК ПЕЧЕНИ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине ° Цель изобретения — повышение функциональной активности изолированных клеток печени. Для получения гепатоцитов перфузию органа проводят в два этапа раствором Локка, причем на втором этапе в растор вводят ЭДТА, а дезагрегацию проводят с помощью ультразвука в среде, содержащей хлористый кальций. 4 табл.

Лимоннокислый натрий 7, 90

С:

Двууглекислый натрий 0,30

Глюкоза 1,80

Дистиллированная вода Остальное Оа4

Раствор пропускают со скоростью «ф»

25 мп/мин в течение IO-I5 мин (объем

250-350 мл). На втором этапе перфузию проводят раствором Локка, в который вводят 2 мХ ЭДТА (рН 7,4).

Перфузию осуществляют с той же скоростью, расход перфузата 6СО700 мл. Общее время перфузии 3040 мин. После окончани перфузии печень извлекают из брюшной полости, измельчают ножницами в сахарозной р среде, содержащей 1,2 мИ.

Состав среды дезагрегации, г/л:

Сахароза 86 000

Хлористый калий 0,372

Фосфорнокислый калий однозамещенный 0,054 .

Фосфорнокислый натрий

-1463757 двузамещенный 0iO7l

Хлористый магний 0,076

Хлористый . кальций О, 180

Альбумин 10, 000

Дистиллированная вода Остальное

Дезагрегацию осуществляют. с помощью вибрационного устройства при час готе 50 Гц в течение 60 с. Полученную суспенз.ию фильтруют через нейлон 10 проводят очистку первичной суспении гепатоцитов серией отмывок для даления поврежденных клеток. После того полученные клетки ресуспендирут в среде 199 с таким расчетом, что- 15

ы получилась оптимальная концентраия 1-3 х10 кл/мл (объем 150-200 мл), Количество неповрежденных клеток пределяют методом окраски трнпановым синим (0,4X).

Функциональную активность (уровень эндогенного дыхания, стимуляции эндогенного дыхания 1-5 мМ сукцинатом, содержание адениннуклеотидов) определяют как свежевьщеленных кле- 25 ток, так и после культивирования (в суспензии) .

Результаты опытов по определению выхода гепатоцитов (п = 10) приведены в табл. l. 30

Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что предлагае. мый способ позволяет получить жизнеспособные клетки печени,:которые не теряют своей функциональной активнос35 ,ти и после культивирования в суспензии в среде 199.

Клетки, получаемые по известному способу, прокрашиваются трипановым синим на начальных этапах культивирования.

В табл. 2 представлены биохимические показатели функциональной полноценности клеток (и = 10), полученных по известному и по предлагаемому спо- 4 собам.

Из табл. 2 видно, что уже на этапе вьщеления клетки характеризуются высоким эндогенным дыханием (в 5,2 раза превышает данные известного спо- б0 соба) ° Дыхание не изменяется в процессе двухчасового культивирования в условиях суспензии. Сукцинат (1-5 мМ) в норме, не проникающей через плазматическую мембрану, в 1,б раза меньше стимулирует эндогенное дыхание по сравнению с известным способом. КульI тивирование клеток, полученных по изобретению, не изменяет степень стимуляции эндогенного дыхания сукцинатом. Коэффициент дыхательного контроля сукцината (Ч,„ /V,„„„„) не превышает 1,33 у свежевьщеленных, в то время как для культивированных клеток он несколько ниже.

У полученных гепатоцитов при культивировании способность сохранять высокое содержание АТФ. значительно возрастает и достигает величин, харак- . терных для перфузируемой печени, что также является подверждением высокой функциональной активности получаемого материала.

Пример 2. Способ осуществляют.аналогично примеру 1, но с тем отличием, что ерфузию печени осуществляют только раствором Локка (без добавления ЭДТА на втором этапе) (табл. 3).

Из табл. 3 видно, что перфузия печени раствором Локка, не содержащим хелатирующего агента ЭДТА, приводит к значительно меньшему выходу функционально полноценных клеток (в расчете на влажный вес печени).

Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но с тем отличием, что дезагрегацию клеток проводят в сахарозной среде, используемой в прототипе (без СаС1 ).

Результаты приведены в табл. 4 (n = 4).

Из табл. 4 видно, что при дезагрегации клеток в среде, используемой в известном способе, количество †жизнеспособных клеток резко снижается.

Формула изобретения

Способ получения изолированных клеток печени, включающий перфузию органа с последующей его дезагрегацией в сахарозной среде с помощью вибрации, отличающийся тем, что, с целью повышения функциональной активности клеток, перфузию органа проводят в два этапа, раствором Локка, причем на втором этапе в раствор Локка вводят ЭДТА в количестве 2 мИ, а среда дезагрегации содержит хлористый кальций в количестве 1,2 мМ.

1463757

Таблица l

Колич е ст во кл е то к, 7.

Количество клеток, млн

Способ на вес на 1 г пепечени чеки

Свежевы- После кульделе нные тивиров ания

Известный 586117 58,0+2,0

Предлагаемый 236220 26,3<4,0

3+0,5

9421,8

98 0, 4.

91+2,0

Т а б л и ц а 2

Спо соб 7 у цд (НМО,A lO кл/мин) СЗКк, / На к (Hl IOð

«10 кл/мин) Содержание АТФ; нМ на 10 кл. веже- Культиыде- вироенные ванные

Свеже- Культивыде- вироленные ванные

Свеже вы- Культиви-. деленные рованные Известный 2,32+

<0,3

4,8+0,3

2,06

17,3+1,9 22, 7+

+2,1

20,6+ 1 «33 1,20 22,1+-3,0 41,2+5,0

+1,9 .

17, l+

-2,0

Таблица 4

Т а.б л и ц а 3

Способ перфузии

Количество клеток на вес печени, млн ноценных клеток, 7

Раствором Лок— ка одиозтапно 78,5+0,8 81+2,5

Предлагаемый 236,0+2,0 9112,0

75 й3,0

9!+2,0

Со ставитель О. Жакетов

Редактор Г.Волкова Техред Л.Олийнык Корректор Н. Король

Заказ 790/31 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский .комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Предлагаемый

Колич е ст во функционально полСвеже- Культивыде- вироленные ванные 0. Известный способ

Предлагаемый способ

5,8+0,7

236+2,0