Способ получения субкультуры клеток человека и животных

 

Изобретение относится к технике культивирования клеток для организма и может найти применение в биологии и медицине. Целью изобретения является повышение жизнеспособности субкультуры. Для этого в состав культуральной питательной среды вводят сыворотку крови собаки и после образования монослоя культуру помещают в холодильник при 4-6°С НА 12-24 Ч. В РЕЗУЛЬТАТЕ ЭТОГО МОНОСЛОЙ ПОЛНОСТЬЮ ОТДЕЛЯЕТСЯ ОТ ПОДЛОЖКИ, И ПОСЛЕ ПИПЕТИРОВАНИЯ ОБРАЗУЮТСЯ МЕЛКИЕ КЛЕТОЧНЫЕ АГРЕГАТЫ, ПРОЦЕНТ ЖИВЫХ КЛЕТОК В КОТОРЫХ ПО ТРИПАНОВОЙ ПРОБЕ СОСТАВЛЯЕТ 95-99%.

Взамен ранее изданного

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК щ) С 12 И 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H АВТОРСНОМЪГ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1, (21) 4 29! 323/28-1 3 (22) 29.07.87 (46) 15.09.90. Бюл. М 34 (71) Институт биологической физики. . АН СССР

{72) В.В.Архипов (53) 578.085.23 (088.8) (56) Вуап et al. Tissue and Cell 1980, 12, N - 4, рр. 619-635 °

Graham et а1. Surpery 1982, v, 91, У 5, рр. 550-559.!

Изобретение относится к технике культивирования клеток вне организма и. может найти применение в биологии и медицине, Целью изобретения является повышение жизнеспособности и сохранение нормальных функций клеток.

П р и и е р 1, Эндотелиальные клет, ки аорты взрослой собаки выделяют механическим соскабливаниемих скальпелем со стороны интимы. Клеточные агрегаты размельчают пипетированием в среде Игла МЕМ и центрифугируют. Клетки ресуспендируют в lQ мп питательной среды Игла NEN и разливают по 5 лат в два фпакона "Фапкон". Причем в один из них вносят 20% эмбрионапьной сыворотки коровы (контрольная культура, s другой — 20% собачей сыворотки (опытная культура) . Смену питатель ных сред на соответствующие производят через 2"3 суток. Через 12 суток культивирования при 37 С в обоих флаконах образовался монослой эндотели„„ЯО„, 147О765 И

2 (54) СПОСОБ ПАССИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к технике культивнров ания клеток вне ор ганизма и может найти применение в биологии и медицине. Целью иэ обретения является повышение жизнеспособности и сохранение нормальных функций клеток. Для этого клетки человека и животных культивируют в среде, содержащей сыворотку крови собаки, а отделение монослоя осуществляют на холоде при температуре о

4 — (плюс) 6 С в течение 12-24 ч. альных клеток с типичной морфологией"булыжной мостовой". Затем кучьтуры помещают в термастат Ц-1241М с темпео, ратурой 6 С. Через 24 ч культуры вы нимают из термостата-холодильника и просматривают под ла кроскопом. В контрольной культуре моно слой клеток остается прочно прикрепленным к подложке, тогда как в культуре с 20% собачьей сыворотки монослой полностью от деляется от подложки и плавает в среде в виде пленки размером 5 7 си. После энергичной тряски флакона с клеточ= ной пленкой и последующего нипетирования образ овы ваются не б ольшие агре гаты, содержащие в среднеи по 5-15 кпеток, которые нересеваются в свежую среду Игла с 20% собачьей сыворотки в соотношении 1:б.

Часть клеток при этом используют дпя оценки их жнзпеспособности посредствои окраски трипановым синим, Количество жизчеспособных (т. е. непоглотивших краситель) клеток в исходной

1470765 суспензии составляет 95, Через 4-5 ч> после помещения культуры в термостат при 37 С практически все клетки прикрепляются к подложке и распластывают5 ся.

Для отделения клеток от подложки в контрольной культуре используют

О, l -ный раствор трипсина в солевом буфере. В результате получают суспен- 1п вию единичных клеток, которая также пересевается в соотношении 1:6 в среду Игла +20X эмбриональной сыворотки коровы. Окрашивание пробы этих клеток трипановым синим показывает, что коли-15 чество жизнеспособных клеток не превышает 80, а время прикрепления их к подложке и распластывания более 12 ч.

Дальнейшее пассирование контрольной и опытной субкультур известным и предлагаемым способом (т.е. без использования ферментов) показывает, что после четвертого пересева эндотелиальные клетки в контрольной культуре резко снижают скорость роста и сре-25 ди них появляются аномальные гигантские клети, тогда как в опытной культуре изменений клеток по этим характеристикам не происходит, После пятого пересева клетки в контрольной культу-, ЗО ре полностью дегенерируют, тогда как опытная культура пересевается восемь раз без каких-либо заметных изменений в скорости роста и морфологии.

Пример 2. Перевиваемые фибробласты мыши линии Я3 Н выращивают в среде 199+10X бычьей сыворотки до образования монослоя. Обработкой моиослоя этих клеток раствором 0,25 трипсина получают суспенэию фибробластов в среде 199, Полученную суспензию клеток NIH. плотностью 35 тыс/мп помещают в шесть флаконов Карреля по 7 мл в к аждыи.

В три из них добавляют 10 бычьей сыворотки (контрольные культуры), в три других — 5 бычьей сыворотки плюс

5% собачьей сыворотки (опытные культуры) и их помещают в термостат при

37 С. Периодически культуры просматри- О вают под микроскопом. В опытных культурах образование моноспоя происходит через 3,5-4 суток, в контрольных— на 4,5-5 сутки..После образования монослоя опытные культуры помещают в термостат +4 С. Через 12 ч нахождения при 4 С в опытных культурах отмечают значительные участки отслоившегося от !. подложки монослоя и после встряхивания флаконов происходит его полное открепление. Посредством пипетирования клеточные пленки разбивают до образования суспенэии агрегатов в среднем по 3l0 клеток в каждом. Окрашивание этой суспензии показывает, что 98 клеток жизнеспособны. Время их распластывания на подложке после посева в свежую среду составляет l 0-1,5 ч в обоих типах сред.

В контрольных культурах отделение клеток проводят обработкой их монослоя смесью трипсин-версена в соотношении 1:4. Количество жизнеспособных клеток по трипановой пробе составляет

82 . Время распластывания фибробластов после пересева составляет от 1,5 до 2,5 ч.

Пример 3. Фибропласты линии

ВНК-21 культивируют до образования монослоя и затем обрабатывают раствором 0,25 трипсина с целью получения суспензии единичных клеток. Полученные клетки высевались в среду Игла

MEM в два флакона Карреля. В один из них добавляют 10 бычьей сыворотки, в другой -5 бычьей сыворотки +5X сыворотки собаки, Через 3 суток в обоих культурах фибробласты образовывают монослой. Флакон с культурой, содержащей сыворотку собаки, помещают в термостат при 5 С. Через 15 ч такой инкубации происходит полное от= крепление клеток от стекла. После пипетирования и окраски трипановым синим устанавливают подсчетом, что 99 клеток являются жизнеспособными.

Г нтрольная культура обрабатывается 0,25 -ным раствором трипсина. Трипановая проба показывает, что жизне-. способными являются 82 клеток.

Формула изобретения

Способ пассирования клеток человека и животных, включающий их выращивание в среде, содержащей сыворотку крови собаки, и последующее отделение образовавшегося монослоя от подложки, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности и сохранения нормальных функций клеток, отделение монослоя осуществляют инкубацией культуры клеток на холоду при температуре 4-6 С в течение .12-24 ч.