Способ определения содержания креатинфосфата и креатина в биологической ткани

 

Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения в биологических объектах креатина и креатинфосфата. Целью способа является сокращение время анализа и повышение чувствительности. Время анализа сокращается в 10 раз чувствительность способа 0,0014 мкМ по сравнению с 0,46 мкМ в прототипе. Способ осуществляется путем регистрации креатина до и после гидролиза креатинфосфата, причем гидролиз креатинфосфата осуществляют водным раствором HCLO<SB POS="POST">4</SB> в течении 2 мин при 100°С, а определение креатина проводят на флуориметре при длине волны возбуждения 360-420 нм и флуоресценции 480-510 нм.

сОюз сОветсних сОциАлистических

РЕСПУБЛИК

091 (И) (51)4 0 01

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ .Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

8MG0IO

ЯАТЕНТЮ- Т

БИБЛИ

ГОСУДМ СтВЕННЫй НОМИ

ПО ИЗОБРЕТЕНияМ И ОткрЫтиям

ПРИ П Нт ССО (21) 4284394/88-14 (22) 15;07.87 (46) 30.07.89. Бкл. Ф 28 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) С.Ф.Дрозд, Н.В.Филатова, С.В.Обух и И.М,Носова (53) 612.015 (088,8) (56) Попович М.И., Северин В.В., Пыров В.Г, Энергетический метаболизм и ультраструквура при аутоиммуной кардиогипопатии. ; Бюллетень экспе риментальной биологии и медицины, 1986, с. II, У 12, с. 671-.674. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ

КРЕАТИНФОСФАТА И КРЕАТИНА В БИОЛОГИ-

ЧЕСКОЙ ТКАНИ

;(57) Изобретение отвосиуся к медициИзобретение относится к медицине, а именно к способам определения кон- .центрации креатинфосфата и креатина в тканях органов человека и животных, Цель изобретения — увеличение чувствительности и ускорение способа путем осуществления экстракции и гидролиза креатинфосфата водным раствором HClOq с пос."едующей реги-. страцией креатина на флюориметре.

Общее время анализа предлагаемым способом занимает около 20 мин (по прототипу 2 ч).

Способ осуществляется следующим образом.

Замороженную ткань растирают в фарфоровой стуйке.с жидким азотом, навеску растертой ткани заливают

2 не, а именно к методам дпределения в биологических объектах креатина и креатинфосфата. Целью способа является сокращение время анализа и поъышение чувствительности. Время анализа сокращается в 10 раз,.чувствительность способа 0,0014 мкМ по сравнению с 0,46 мкМ в прототипе. Способ осуществляется путем регистрации креатина до и после гидролнза креатинфосфата,причем гидролиз креатинфосфата осуществляют водным раствором

НС10+ в течении 2 мин при 100 С, а определение креатина проводят на флюориметре при длине волны возбуждения 360-420 нм и флюоресценции .

480-510 нм. 1 табл. холодной (4 С) 0,5 М НС10 (1 мп на

40 мг ткани) и гомогенизируют в тече в 4 ние одной минуты в стеклянном гомо- 1© генизаторе Поттера. Центрифугируют

10 мин при 3000 об/мин. По 0,2 мл фф супернатанта отбирают в две пробирки. е,ф

К содержимому первой пробирки добавляют О,1 мл 2 M КОН. Вторую пробирку помещают на 2 мин в кипящую водяную баню для гицролиза креатинфосфата, после чего ее помещают на лед и к содержимому добавляют 0,1 мл 2 М KOH.

На дно пробирки выпадает осадок перхлората калия. По 0,1 мл надосадка из каждой пробирки переносят в про бирку для определения концентрации креатина, В пробирку с образцом добавляют l мл 1Х-ного спиртового раствора нингидрина, тщательно переме.

3 1497576 ш!(вают, через 1 мин добавляют 2 мл

lOX-ного КОН, через 4 мин после добавления 10Х-ного КОН измеряют интенсивность флюоресценции при Ь„ „

495 нм при длине волны возбуждающего света Ли, = 390 нм. ОдновреMIBHHo контрольный и c(гандартный образцы обрабатывают аналогичным обраэрм нингидриновым реактивом и ще- !О ! лочью. Контроль 0,5 мл воды, станд рт 0,45 мл воды и 0,05 мл раствор креатина 2,5 мМоль. Расчет содерж ния в ткани метоболитов осуществляе ся по формулам: !5 !

А-к

К =- — — — -хРхС об(((ст — к в

В-к

К =.— — — — -хРхС сб. Ст-к

А — В

КФ = К вЂ” К = —.— — — — хРхС обц ñ8 ст-к

1 где К

a((ö

К св содержание общего креати- 25 на в ткани, мкмоль/г; содержание свободного креатина в ткани, мкмоль/r; содержание креатинфосфата в ткани, в мкмоль/г; интенсивность флюоресценции образца после гид4 ролиза; интенсивность флюоресценции образца без гидролиза; интенсивность флюоресценции контрольного образца; интенсивность флюореспенции стандартного образца; 40 коэффициент разведения, равный 18,75; концентрация стандарта креатина, равная

2,5 ммоль/л.

КФ А к ст

Пример 1. Навеску 100 мг

1 кани икроножной мышцы задней конечности крысы поместили в жидкий азот, растерли в фарфоровой ступке и залили 2,5 мл 0,5 М HClO . Гомогенизировали в стеклянном гомогениэаторе Пот-! ера 1 мин и центрифугировали при

3000 об/мин в течение 10 мин при 4 С.

В две пробирки (А и Б) отобрали по

0,2 мн надосадочной жидкости. В пробирку А сразу добавили 0,1 мл 2 M

КОН. Пробирку Б поместили на 2 мин в кипящую водяную баню при 100 С,затем в воду со льдом и добавили 0,1 мл

2 М КОН. Из пробирок А и Б перенесли по 0,1 мл жидкости в пробирки А и Б и добавили по 0,4 мл воды. В пробирку К (контроль) поместили

0,5 мл воды, а в пробирку ст (стандарт) — О, 45 мл воды + 0,05 мл стандартного раствора креатина, содержащего 2,5 мМоль/л. В пробирки А и

Б, ст, к добавили по 1 мл спиртово( го раствора нингидрина, через 1 мин туда же добавили по 2 мл !ОХ-ного

КОН и ровно через 4 мин после добавления 1ОХ-ного КОН измерили интенсивность флюоресценции проб на флюориметре "ВИАН-130" при Л п((к =

365 нм» " л„ор = 510 нм. Получили следующие значения интенсивности флюоресценции в относительных единицах: I = 29 I = 52 т = 2 °

Д В У вЂ” (9

Хот = 51.

Содержание свободного креатина в ткани рассчитывали по формуле: ( тд — тк —: —.— — — х 18,75 х 2,5. т- т т

-- Ст — К

Получили значение 25,81 мкМ/г.

Содержание креатинфосфата рассчитывали по формуле: о . т, т „, х 18,75 х 2,5. — ст — К.

Получили значение 22,0 мкМ/г.

Пример 2. Способ использовали для определения содержания креатинфосфата и креатина в икроножной мышце крыс в норме и при 30-минутной ишемии задних конечностей. Ишемию вызывали наложением резинового жгута на верхнюю треть бедра. Определение содержания креатинфосфата и креатина осуществляли аналогично примеру 1. Результаты представлены в таблице.

Характеристика способа.

Способ позволяет определять содержание креатинфосфата в тканях до

095 мкМ/г, креатина до 0,2 мкМ/г.

Определяли содержание креатинфосфата и креатина в 10 параллельных образцах. Для креатинфосфата М

= 8,9; С, = 10,1; 6 = 0,9; для креатина М = 18,1; 6 = 0,6; С „ = 3,1.

Формула изобретения

Способ определения содержания креатинфосфата и креатина в биологической ткани, включающий экстракцию

497576 б фосфата осуществляют водным раствором НС104 в течение двух минут нри е

100 С, а определение креатина npasoдят на флюориметре при длине волны возбуждения 360-420 нм и флюоресцен дни 480-510 нм„

5 1 кислотой, гидролиз креатинфосфата до креатина и регистрацию содержания креатина до и после гидролиза, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, гидролиз креатинОпределение содержания креатинфосфата и креатина предложенным способом в нормальной и ишемизированной икроножной мышце крысы

Содержание креатина мкМ/г

Груп- И па и/п

Содержание

ИнтенсивИнтенсивность флюорескреатинфосфата, мкМ/г ность флюоресценции пробы после ценции до гидролиза гидролиза

24,5

25,5

25,5

25,5

25,0

27,0

26,5

26,5

17,0

17,5

18,0

17,0

18,0

17,0

17,0

16,5

2

4

6

Норма

27,5

25,5

25,5

23,5

25,5

25,5

25,0

23,5

29,5

28,5

28,0

25,5

26,5 . 28,5.

28,5

27, 5.

Ише- 1 мия 2

30 ми- 3 нут 4

5 6

М + m

П р и м е ч а н и е, Контроль 1; стандарт 43, Составитель В.Митюшин

Редактор Л.Пчолинская ТехредЛ.Олийнык Корректор Л,Бескид

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г;Ужгород, ул. Гагарина, 101

8,37

8,93

8,37

9,49

7,81

11,16

10,60

11,16

9,491 й0,47

2,23

3,35

2,23

2,23

1,12

3 35

3,91

4,46

2,86+

+0 39

Заказ 4439/47 Тираж 789 Подписное

17,86, 18, 42

18,97

17,86

18,97

17,86

17,86

17,30

18,14+

+О,?1

29, 58

27,34

27,90

25,11

27,34

27,34

26,79

25,11

27,06

+0,52