Способ получения сорбента для иммобилизации липолитических ферментов

 

Изобретение относится к способу получения сорбента для иммобилизации и позволяет повысить каталитическую активность иммобилизованной липазы и увеличить ее стабильность в водно-органических средах. Полиамид растворяют в концентрированной НС1, выдерживают с лизопористым кремнеземом в течение 1,5-2 ч при перемешивании, удаляют неадсорбированный полиамид, активируют в 2,0-3,0 н. НС1 ПРИ 40-45°С В ТЕЧЕНИЕ 1,5-2 Ч. СОРБЕНТ ПРОМЫВАЮТ ВОДОЙ, УРАВНОВЕШИВАЮТ С 0,1 М БОРАТНЫМ БУФЕРОМ РН 8,5-9,5, ЗАТЕМ МОДИФИЦИРУЮТ ЕГО ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ ПРИ 15-20°С В ТЕЧЕНИЕ 2 Ч. КОВАЛЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛИГАНДА - ПЕФАЛИНА ПРОВОДЯТ В ТОМ ЖЕ БУДЯРНОМ РАСТВОРЕ ПРИ 2-6°С В ТЕЧЕНИЕ 24-30 Ч. 5 ТАБЛ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„ у„„151О859 д (5И 4 В 01 D 15/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

40 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4213794/31-26 (22) 19.03.87 (46) 30.09.89. Бюл. № 36 (71) Ташкентский государственный университет им. В. И. Ленина (72) М. M. Рахимов, Х. Т. Хасанов, И. Т.

Якубов, Н. А. Латышев, В. Н. Акулин, Л. М. Энштейн и С. П. Касьянов (53) 543.544 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 762917, кл. В 01 D 15/08, 1978. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА

ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к способу получения сорбента для иммобилизации и позИзобретение относится к технической биохимии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой и микробиологической промышленности для получения иммобилизированных липаз.

Цель изобретения — повышение каталитической активности иммобилизованной липазы, увеличение ее стабильности в водноорганических средах.

Способ получения сорбента для иммобилизации ферментов заключается в следующем.

Полиамид, растворенный в концентрированной HCI, выдерживают с силикагелем в течение 1,5 — 2 ч при перемешивании, неадсорбированный полиамид удаляют, активируют полученный носитель в 2,0 — 3,0 н. растворе соляной кислоты при 40 — 45 С в течение I;5 — 2,0 ч. Сорбент промывают водой, уравновешивают с 0,1 М боратным буфером, рН 8,5 — 9,5, затем модифицируют его глутаровым диальдегидом при 15 — 20 С в течение воляет повысить каталитическую активность иммобилизованной липазы и увеличить ее стабильность в водно-органических средах.

Полиамид растворяют в концентрированной

НСI, выдерживают с лизопористым кремнеземом в течение 1,5 — 2 ч при перемешивании, удаляют неадсорбированный полиамид, активируют в 2,0 — 3,0 н.НС! при 40 — 45 С в течение 1,5 — 2 ч. Сорбент промывают водой, уравновешивают с 0,1 M боратным буфером, рН 8,5 — 9,5, затем модифицируют его глутаровым альдегидом при 15 — 20 С в течение

2 ч. Ковалентное связывание биоспецифического лиганда — кефалина проводят в том же будярном растворе при 2 — 6 С в течение

24 — 30 ч. 5 табл.

2 ч. Ковалентное связывание биоспецифического лиганда — кефалина проводят в том же буферном растворе при 2 — 6 С в течение

24 — 30 ч.

Прил ер 1. К 100 г силикагеля марки КСК № 2 со средним диаметром пор 14 нм, удельной поверхностью 338 м /г и размером частиц от 160 в до 250 мкм приливают 10 г полиамида, растворенного в концентрированной HCI (200 мл), выдерживают при перемешивании в течение 2 ч, затем добавляют 400/О-ный водный ацетон. Надосадочную жидкость удаляют декантацией, сорбент промывают дистиллированной водой до нейтральной среды. Затем полученный сорбент активируют 2 н. HCI при 45 С в течение 2 ч, промывают дистиллированной водой. К влажному сорбенту добавляют 60 мл 0,1 М боратного буфера, рН 8,5 содержащего 3,14 мл

25%-ного раствора глутарового альдегида, и оставляют при перемешивании на 2 ч. Несвязавшийся глутаровый альдегид отмывают

1510859

Формула изобретения

500 мл того же буферного раствора. Для присоединения лиганда к модифицированному полиамиду добавляют 60 мл раствора кефалина с концентрацией 40 мг/мл в 0,1 М буфере, рН 8,5, содержащем 50О/О этанола и оставляют при перемешивании на 24 ч при 4 С.

Несвязанный кефалин удаляют последовательным промыванием сорбента 500 мл этилового спирта и 500 мл 0,1 М боратного буфера, рН 8,5. Для блокирования оставшихся свободных альдегидных групп к полученному сорбенту добавляют 60 мл 0,1 М боратного буфера, рН 8,5, содержащего 3,5 мл

31 аноламина и оставляют при перемешивании на 24 ч при 4 С. Избыток этаноламина удаляют промыванием сорбента 30 мл того же буферного раствора.

Пример 2. Синтез сорбента проводят, как в примере 1, с той разницей, что покрытие силикагеля полиамидом проводят в соотношении от 10:0,5 до 10:5.

Пример 8. Синтез сорбента проводят, как в примере I, но на стадии присоединения лиганда к модифицированному сорбенту количество кефалина в инкубационной смеси составляет от 0,5 до 1,5 г в 60 мл 0,1 М боратном буфере, рН 8,5, содержащем 50 /о этанола.

Пример 4. Синтез сорбента проводят, как в примере 1, с той разницей, что в качестве твердой подложки используют силикагель со средним диаметром пор 3,2 нм.

Пример 5. Синтез сорбента проводят, как в примере 1, с той разницей, что в качестве твердой подложки используют силикагель со средним диаметром пор 8 нм.

В табл. 1 представлена сравнительная характеристика сорбентов, синтезированных предлагаемым и известным способом, при использовании для иммобилизации липазы из гриба.

Из представленных данных в табл. 1 видно, что иммобилизованная липаза из гриба на предлагаемом сорбенте сохраняет в водной среде высокую (85О/p) активность, а в случае проведения реакции в водно-ацетоновой среде даже повышает свою активность. ! 1ри использовании сорбента синтезированных Ilo известным методам иммобилизованНая IHI133;1 обладает НН3КОН уge 1bHOH BKTHBпостыл.

В табл. 2 представлены данные по влиянию соотношения силикагеля и полиамида при синтезе сорбента на удельную активность иммобилизованной липазы на этих носителях.

Из табл. 2 видно, что оптимальным является массовое соотношение носителя и полиамида 10:1.

В табл. 3 приведены данные о влиянии массового соотношения сорбент-лиганд на положительный эффект.

Из представленных результатов видно, что оптимальным является соотношение сорбента и лиганда (кефалина) 10:1.

В табл. 4 представлены данные о влиянии диаметра пор на каталитическую активность иммобилизованной липазы.

Наиболее высокая удельная активность наблюдается в том случае, когда в качестве твердой подложки используют кремнеземы с размером пор не ниже 8 — 10 нм, но и при

3,2 нм предложенный способ превосходит известный, т.е. мезопористый кремнезем обеспечивает положительный эффект.

В табл. 5 приведены результаты применения иммобилизованных липаз в конкретных процессах (гидролиз и переацилирование ры бьего жира и льняного масла) для получения продуктов обогащенными полиеновыми жирными кислотами.

Для проведения реакции переацилирования к исходным веществам добавляют равное количество (1:1, по массе) фракции жирных кислот с содержанием эйкозопентаеновых кислот 95 /о.

Способ получения сорбента для иммобилизации липолитических ферментов, включающий активацию полиамидсодержащего носителя, обработку его глутаровым альдегидом и ковалентное присоединение лиганда, отличающийся тем, что, с целью повышения каталитической активности иммобилизованной на сорбенте липазы и увеличения ее стабильности в водно-органических средах, в качестве носителя используют мезопористый кремнезем с нанесенным полиамидом.

1510859

Таблица!

Сорбент по способу и ) Показатели звестный Предлагаемый

Удельная активность* липаз, мкмоль/ч на r носителя: водная среда

25Х-ная водно-спиртовая среда

25Х-ная водно-ацетоновая среда

Х сохранения активности после иммобилизации в водной среде

Время полуинактивации, мин, р 50 С в 25Х спиртовом растворе

Удельная поверхность носителя, м2 /r

Содержание кефалина, мкмоль, на 1 г сорбента

Адсорбционная емкость кефалина в ед. липазы на мкмоль лиганда

1200

110

1000

2100

85

85

600-750

0,25-0,28

2,2-2, 5

230

5520

"В качестве субстрата используют триглицериды рыбьего жира.

Т а блица 2

Массовое соотноыение силикагель:полиамид

10:О, 1 10:0,5 10:1

10:3

10:5

Удельная активность мкмоль/ч на 1 г носителя*

760

1050

1200

1150

1200

*В качестве субстрата используют триглицериды рыбьего жира.

Таблица3

Массовое соотношение сорбент. лиганд

20:1 10:1 7:1 4:1

Удельная активность, мкмоль/ч на 1 r

Э

1020 12 10 1200 1190 носителя

1510859

Таблица4

Вид используемого носителя

Удельная активность иммобилизованной липазы, ед/г

Пример, №

1200

338

1140

600-750

760

715

3,2

Т а б л и ц а 5

Переацилирование эйкозопентаеновыми кислотами

Гидролиз рыбьего жира по способу

Показатели по способу

Известному Предлагаемому

Известному Предлагаемому

Рыбий жир

Исходное вещество

Глубина превращения, 7, 40

Содержание полиеновых жирных кислот в диглицеридах, X

Льняное масло

25,4

52,0

36,6

Составитель Т. Чиликина

Редактор В. Ковтун Техред И. Верес Корректор С. Черни

Заказ 5687/7 Тираж 600 Под пи сн ое

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат «Патент», г. Ужгород, ул. Гагарина, Oi

Силикагель

КСК ¹ 2

Silicagel L

160/250

Силикагель

КСК I "- 5

Размер пор Удельная поносителя, верхность нонм сителя, м2 /г