Способ получения карбоксипептидазы а и карбоксипептидазы в из поджелудочной железы свиньи

 

Изобретение относится к способу комплексного получения ферментов из животного сырья, а именно карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В, применяемых в биохимии для структурных исследований. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ включает экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, выделение и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Экстракцию проводят 0,005 М трис-HCL буфером, из полученного экстракта сульфатом аммония при степени насыщения 0,64-0,66 осаждают комплекс карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В, причем сначала элюируют карбоксипептидазу В в линейном градиенте концентрации хлорида натрия от 0 до 0,25-0,26 М в 0,005 М трис-HCL буфере, после чего 0,26 М раствором хлорида натрия в 0,005 М трис-HCL буфере элюируют карбоксипептидазу А. Буферный раствор на всех стадиях имеет PH 7,5-7,6.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) 42 А1 (51)5 С 12 N 9/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4344108/30-1 3 (22) 15,12.87 (46) 23.03.90. Бюл. !(11 (7!) Научно-производственное объединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им . П,Стучки (72) Д.Ж.Менес, A.À.Ìàðíàóçà, А.Х,Швагере, Д.А.Клявиня, Т.Ф.Фридман и М.П,Путере (53) 663.15(088.8) (56) Folk J.R., Schirmer E,W. The

Porcine Pancreatic Carboxypeptidase а System. — Journal of Biological

Chemistry, 1963, ч. 238, р. 3884-3894.

Dia R.D., Srivastava S.Ê. А Method

for Simultaneous Purification of

Carboxypeptidase а and В from Goat

Pancreas and the Product Stabilization of Goat Carboxypeptidase В.

Journal of Molecular Catalysis, 198!, v. 10, !1 -. Э, р. 253-268. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ А И КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ В ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ СВИНЬИ

Изобретение относится к способу комплексного получения ферментов из животного сырья, а именно карбоксипептидазы (КП) А и КП В, применяемых в биохимии для структурных исследований.

Целью изобретения является повьппение выхода целевого продукта и упрощение способа.

Способ включает экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, выделение и очистку целевого продукта ионообменной хроматографи2 (57) Изобретение относится к способу комплексного получения ферментов из животного сырья, а именно карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В, применяемых в биохимии для структурных исследований. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа, Способ включает экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, выделение и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Экстракцию проводят 0,005 M трис-НС1 буфером, из полученного экстракта сульфатом аммония при степени насьпцения 0,64-0,66 осаждают ком плекс карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В, причем сначала элюируют карбоксипептидазу В в линейном градиенте концентрации хлорида натрия от 0 до 0,25-0,26, М в 0,005 М трис-НС1 буфере элюируют карбоксипептидазу А. Буферный раствор на всех стадиях имеет рН 7,5-7,6. ей на ДЭАЭ-целлюлозе. Экстракцию проводят 0,005 М трис-НС1 буфером, из полученного экстракта сульфатом аммония при насьпцении 0,64-0,66 (рН

7,5-7,6) осаждают комплекс КП А и КП

В, который разделяют на хроматографической колонке последовательным элюированием КП В и КП А, причем сначала линейным градиентом при возрастакчцей концентрации натрия хлористого до

0,25-0,26 М в 0,005 1" трис-НС1 буфере элюирукт КП В, после чего

0,26 М раствором натрия хлористого

1551742 в 0,005 М трис-НС1 буФере выделяют

КП А, à рН буферного раствора на всех стадиях 7,5-7,6.

П р им е р 1.

I Приготовление ацетонового порошка.

0,7 кг свежезамороженных поджелудочных желез разрезают на кусочки толщиной 4-6 мм и проводят автолиз при комнатной температуре 20-24 ч.

Полученную массу обрабатывают при комнатной температуре четырьмя объемами ацетона, интенсивно перемешивая в течение 1 мин. Аналогично проводят обработку желез еще 3 раза ацетоном, смесью ацетона и эфира (1:1) и эфиром, Обработанные железы сушат при комнатной температуре, II. Экстракция, Ацетоновый порошок иэ автолизированной поджелудочной железы свиньи перед экстракцией размельчают в электрической лабораторной мельнице.

К 140 r ацетонового порошка добавляют 1400 мл 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,5) и перемешивают 45 мин на магнитной мешалке при комнатной температуре. Осадок отделяют центрифугированием. Получают 1300 мл центрифугата желтоватого цвета. рН экстракта доводят до 7,5 с помощью 1 М раствора NaOH.

III ° Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония.

К экстракту по порциям, перемешивая на магнитной мешалке, добавляют сульфат аммония до 0,64 насыщения (422,3 г/л), поддерживая рН 7,5

1 M раствором NaOH.Продолжают перемешивать еще 30 мин. Центрифугируют

40 мин при 6000 об./мин при 3 С.

Белковый осадок, содержащий КП A u

КП В, суспендирую в 350 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,5), помещают в целлофановые мешочки и диализируют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 24 ч против охлажденного 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,5). Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают, Центрифугат в количестве 400 мл используют для дальнейшей очистки, IV. I хроматография ча колонке

6 х 25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером (рН 7,5).

Па колонку наносится 400 мл раствора белка, полученного на стадии

III. Колонку промывают 5 л 0,005 М трис-НС1 буферного раствора (pH 7,5) для освобождения от неадсорбированного белка. Белковую Фракцию КП В элюируют линейным градиентом концентрации ИаС1: в первом сосуде — 1 л

0,005 HC1 (pH 7,5), а во втором — 1 л этого же буфера с

0,25 М NaCI.Îáúåäèíÿþò фракции с удельной активностью КП В не менее

50 ед/мг белка (600 мл).

Белковую фракцию КП А элюируют

1 л 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,5) с 0,25 M КаС1. Объединяют фракции с удельной активностью КП А не менее 12 ед/мг белка (520 мл).

К полученным с колонки хроматографическич фракциям КП А и КП В добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения..Осадок отделяют центрифугированием в течение 1 ч при

6000 об/мин. и 3 С и растворяют в 50 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,5). Растворы помещают в целлофановые мешочки и диалиэуют против

0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,5).

Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

Центрифугаты КП A (45 мл) и КП В (50 мл) используют для дальнейшей очистки, V. Очистка KII В хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Диализат от стадии IV содержащий

КП В активность, наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (2,9 25 см), уравновешанной 0,005 M трис-HCI буфером (pH 7,5) со скоростью течения 3040 мл/ч, отмывают от неадсорбированных белков 800 мл этого же буфера.

Элюирование КП В проводят линейным градиентом NaCI: в первом сосуде

500 мл 0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,5), а во втором — 500 мл этого же буфера с 0,25 М NaC1. Объединяются фракции с удельной активностью

КП В не менее 100 ед/мг белка. К элюату добавляют сульфат аммония до

0,65 насыщения, осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 20 мл

0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,5).Диа лизуют в течение 24 ч против

0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,5), Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

1551742

Выход 20 мл раствора фермента с удельной активностью КП В 149 ед/мг белка, выход по активности 35,77, VI. Очистка КП А хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

45 мл раствора КП А от стадии IV наносят на колонку с ДЭЛЭ-целлюлозой уравновешенной 0,005 M трис-НС1 буфе ром (рН 7,5) со скоростью течения

30-40 мл/ч, отмывают от неадсорбиро— ванных белков 1 л этого же буфера °

Потом ставится градиент: в первом сосуде 1 л 0,005 М трис-НС1 буфера (pH 7,5), а во втором — 1 л этого же буфера с 0,3 М NaC1. Объединяются фракции с удельной активностью KII А не менее 16 ед/мг белка (200-300 мл).

К элюату медленно по порциям, перемешивая на магнитной мешалке, добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения. Осадок отделяют центрифугированием в течение 50 мин при

6000 об/мин при 3 С и растворяют в

20 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,5)

Диализуют против 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,5) в течение 24 ч. Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

VII, Кристаллизация КЛ А, Центрифугат помещают в целлофановые мешочки и диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч. Осадок КП А отделяют центрифугированием в течение 1 ч при 15000 об/мин при 3 С и суспендируют в 40 мл дистиллированной воды, медленно перемешивая на магнитной мешалке 30 мин для отмывки от растворимых в воде примесей. Осадок отделяют центрифугированием и вновь суспеиднруют в 20 мл воды. К суспензии медленно по каплям, провеняя рН, прибавляют 0,1 М Na0H до рН 6,8, Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Центрифугат помещают в целлофановые мешочки и диализуют в течение

36 ч против дистиллированной воды.

К образовавшейся суспензии кристаллов КП А добавляют 1 мл толуола (5X от объема суспензии).

Выход 20 мл суспензии фермента, содержащей 4000 Е VJI А с удельной активностью КП А 29,7 ед/мг белка, выход по активности 327 (по международным единицам определения активности ферментов).

П риме р2.

I . Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру 1.

II Экстракция.

Ацетоновый порошок перед экстракцией размельчают. К 140 г ацетонового порошка добавляют 1400 мл 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,55) и перемешиIð вают 45 мин при комнатной температуре. Центрифугируют, рН полученного экстракта доводят до 7,55 1 M раствором NaOH.

III. Осаждение ферментного комплекса FII А и КП В сульфатом аммония.

К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,65 насьпцения (430,4 г/л), поддерживая рН 7,55 1 М раствором

Na0H.0ñàäîê отделяют центрифугированием и суспендируют в 350 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,55), диализуют в течение 24 ч против 0,005 M трисНС1 буфера (рН 7,55). Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.

25 IV, I хроматография на колонке с

ДЭАЭ-целлюлозой.

На колонку 6 25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трисНС1 буфером (pH 7,55), наносится

30 400 мл раствора белка от стадии III

Для освобождения от неадсорбированного белка колонку промывают 5 л

0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,55).

КП В элюируют линейным градиентом концентрации NaC1 в первом сосуде ! л 0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,55), а во втором — 1 л этого же буфера с

0,255 М NaC1. Объединяют фракции с удельной активностью КП В не менее

40 50 ед/мг белка (600 мл).

КП А элюируют 1 л 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,55) с 0,255 М МаС1, Объединяют фракции с удельной активностью КП А не менее 12 ед/мг белка, 45 Фракции КП А и КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения..

Осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 50 мл 0 05 M трис-НС1 буфера (рН 7,55) и диализуют против

0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,55), V, Очистка КП В хроматографией на

ДЭАЭ-целлюлозе.

Диализат от стадии IV с КП В активностью наносят на колонку с ДЭАЭ55 целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером (рН 7,55). Отмывают от неадсорбированных белков 800 мл этого же буфера. Потом ставится градиент: в первом сосуде — 500 мл

1551742

0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,55), а во втором — 500 мл этого же буфера с 0,25 Р NaC1. Объединяются фрак- ции с удельной активностью КП В не

5 менее 100 ед/мг белка, осаждаются сульфатом аммония до 0,65 насыщения, Осадок после центрифугирования суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (pH 7,55). Диализуют против

0,005 M трис-НС1 бушера (рН 7,55).

Центрифугируют.

Выход 20,5 мл раствора фермента с удельной активностью КП В 151,5 ед/мг белка, выход по активности 33,77..

VI. Очистка КП Л хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Диализат от стадии IV с КП А активностью наносят на колонку с ДЭАЭцлюлозойэ уравновешенной 09005 М 20 трис-НС1 буфером (рН 7,55), отмывают от неадсорбированных белков

1 л этого же буфера. Потом ставится градиент: в первом сосуде — 1 л

0,005 Р трис-НС1 буфера (pH 7,55), 25 а во втором — 1 л этого же буфера с

0,3 М МаС1. Объединяют фракции с КП

А активностью и осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения. Осадок отделяют центрифугированием и раст- 30 воряют в 20 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,55). Диализуют против

0,005 M трис-НС1 буферна (pH 7,55).

VII. Кристаллизацию КП А проводят аналогично примеру 1.

Выход 19,5 мл с1 спензии фермента с удельной активностью КП A

32,5 ед/мг белка, выход по активнос— ти 31,57. !

ПримерЗ.

I. Приготовление ацетонового-порошка проводят аналогично примеру 1 °

II. Экстракция.

К 140 г ацетонового порошка добавляют 1400 мл 0,005 М трис-НС1 буфера рН 7,6. Перемешивают ч5 мин, центрифугируют, рН экстракта доводят до величины 7,6 1 М раствором NaOH.

III. Осаждение ферментного комплекса КП A и КП В сульфатом аммо50 ния.

К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,66 насыщения (438,8 г/л), поддерживая рН 7,6 1 M раствором

Na0H. Центрифугируют, осадок суспен55 дируют в 350 мл 0,05 М трис-НС1 буфера рН 7,6, диализуют против 0,005 М трис-НС1 буфера рН 7,6.

IV. I хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.

Диализат от стадии III наносят на колонку с ДЭЛЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 M трис-НС1 буфером (рН 7,6), промывают 5 л этого же буфера. Для элюирования КП В ставится градиент: в первом сосуде — 1 л

0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,6), а во втором — л этого же буфера с

0,26 M NaC1. КП А элюируют 1 л

0,005 M трис-НС1 буфера рН 7,6 с

0,26 М ИаС1.

Объединенные фракции КП В и КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщЕния,, отделенный центрифугированием осадок суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере (рН 7,6) и диализуют против 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,6), V. Очистка КП В хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе.

Диализат с КП В активностью наносят на к >лонку с ДЭАЭ -целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером (рН 7,6), элюируют линейным градиентом концентрации NaC1: в первом сосуде — 1 л 0,005 M трис-HCL буфера (рН 7 6) а во втором — 1 л этого же буфера с 0,25 M NaCI Объединенные фракции КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения,, осадок после центридзугирования растворяют в 0,05 М трис-НС1. буфере (рН 7,6).

Диализ проводится против 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,6), Выход 21 мл раствора фермента с удельной активностью КП В 155 ед/мг белка, выхоц по активности 38,3Е.

vVI. Очистка КП А хроматографией на ДЭЛЭ-целлюлозе.

Диализат от стадии IV с КП А активностью наносят на колонку с ДЭАЭi:,eëëþëîçîé, уравновешенной 0,005 М трис-HC1 (pH 7,6), пропускают 1 л этого же бункера. Ставится градиент: в первом сосуде — 1 л

0,005 M трис-НС1 буфер (рН 7,6), а во втором — 1 л этого же буфера с

0„З М NaCI Объединяют фракции с

КП Л активностью, осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения и осадок после центрифугирования растворя ют в 20 мл 0,05 M трис-НС1 буфере (рН 7,6) °,Диализуют против 0,005 М трис-НС1 буфера (pH 7,6).

V1I, Кристаллизацию КП А проводят анало ично примеру 1.

1551742

Выход 20 мл суспензии фермента с удельной активностью КП А 30,2 ед/мг белка, выход по активности 31,8/..

Приме р4.

I. Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру 1.

II. Экстракция.

Экстракцию проводят 0,005 М трисНС1 буфером (рН 7,4), рН экстракта после центрифугирования доводят до величины 7,4 1 M раствором NaOH.

III. Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония, К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,63 насьпцения (414,2 г/л), поддерживая рН 7,4 1 M раствором

NaOH. Осадок после центрифугирования суспендируют в 350 мл 0,05 трис-НС1 буфера (рН 7,4), диализуют против 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,4).

IV ° I хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.

Диализат от стадии III наносят на 25 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером (рН 7,4), пропускают 5 л этого же буфера. Для элюирования КП В ставится градиент: в первом сосуде — 1 л 30

0,005 М трис-НС1 буфера рН 7,4, а во втором — 1 л этого же буфера с

0,24 M NaC1. КП А элюируют 1 л

0,005 М трис-НС1 оуфера (рН 7,4) с

0,24 М NaC1.

Объединенные фракции КП В и КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок после центрифугирования суспендируют в 0,05 М трисНС1 буфере (pH 7,4) и диализуют про- 40 тив 0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,4).

V. Очистка КП В хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, Фракцию КП В от предыдущей стадии наносят на колонку с ДЭАЭ-целлю- 45 лозой, уравновешенной 0,005 М трисНС1 буфером (рН 7,4), элюируют линейным градиентом концентрации NaC1: в первом сосуде — 1 л 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,4), а во втором — 1 л этого же бункера с 0,25 Y NaC1. Объединенные фракции КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок растворяют в 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,4), Диализуют против

0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,4).

Выход 17,5 мл раствора фермента с удельной активностью КП В 107,4 ед/мг белка, выход по активности 247..

VI, Очистка КП А хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. . Фракция КП А от стадии IV наносится на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером (рН 7,4), промывают колонку

1 л этого же буфера. Потом ставится градиент: в первом сосуде — 1 л

0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,4), а во втором — I л этого же буфера с

0,3 М NaC1 Объединенные фракции КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения. Осадок растворяют в 0,05 М трис-НС1 буфере (рН 7,4). Диалиэуют против 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,4).

VII Кристаллизацию КП А проводят аналогично примеру l.

Выход 18 мл суспенэии фермента с удельной активностью КП А 22,6 ед/мг белка, выход по активности 287..

Пример 5.

Е. Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру 1.

II. Экстракция.

Экстракцию проводят 0,005 М трисНС1 буфером (рН 7,7), рН экстракта после центрифугирования доводят до величины 7,7 1 М раствором NaOH.

III. Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония.

К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,67 насыщения (447,2 г/л), поддерживая рН 7,7 1 M раствором

NaOH. Осадок после центрифугирования суспендируют в 350 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7, 7), диализуют против

0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,7).

IV. I хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.

Диализат от стадии III наносится на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером (рН 7,7), пропускают через колонку.

5 л этого же буфера, Для элюирования

КП В ставится градиент: в первом сосуде — l л 0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,7), а во втором — 1 л этого же буфера с 0,27 М NaC1. КП А элюируют 1 л 0,005 M трис-НС1 буфера (рН

7,7) с 0,27 М NaCl. Объединенные фракции КП В и КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насьпцения, осадок суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере (рН 7,7) и диализуют против

0,005 М трис-НС1 буфера (рН 7,7).

V. Очистка КП В хроматографией на

ДЭАЭ-целлюлозе.

1551742

Выход 17 мл суспензии фермента с удельной активностью КП А 20 ед/мг белка, выход по активности 273.

Формула и з о б р е т е н и я

1О

25

Составитель А. Семенов

Редактор Н.Рогулич Техред М.Дидык Корректор Т,Малец

Подписное

Тираж 482

Заказ 309

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент". г.ужгород, ул. Гагарина,101

Хроматографию проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной

0,005 М трис-НС1 буфером (рН 7,7), КП В элюируют линейным градиентом концентрации NaC1: в первом сосуде

1 л 0,005 М трис-НС1 буфера (pH 7,7), а во втором — 1 л этого же буфера с

0,25 М NaC1. Объединенные фракции

КП В осаждают сульфатом аммония до

0,65 насьпцения, осадок растворяют в 0,05 М трис-НС1 буфере (рН 7,7).

Диализуют против 0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,7).

Выход 18 мл раствора фермента с удельной активносФью КП В 115 ед/мг белка, выход по активности 25,4Х.

VI Очистка КП А хроматографией на ДЭАЭ целлюлозе.

Фракция КП А от стадии IV наносится на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером (рН 7,7), пропускают 1 л этого же буфера. Потом ставится градиент, в первом сосуде — 1 л 0,005 М трисНС1 буфера (рН 7,7), а во втором—

1 л этого же буфера с 0,3 М NaC1.

Объединенные фракции КП А осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, осадок растворяют в 0,05 М трис-НС1 буфере (pH 7,7). Диализуют против

0,005 M трис-НС1 буфера (рН 7,7).

VII. Кристаллизацию КП А проводят аналогично примеру 1.

Способ получения карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В из поджелудочной железы cBHHbH включающий экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, получение осадка, выделение и очистку целевого продукта двукратной ионообменной хроматографией, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, экстракцию проводят 0,005 М буфером трис-НС1 с рН 7,5-7,6, полученный экстракт обрабатывают сульфатом аммония при степени насыщения

0,64-0,66 н при рН 7,5-7,6, а ионообменную хроматографию осадка проводят на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,005 М буфере трис-НС1 с рН 7,5-7,6 в градиенте концентрации хлорида натрия от

0 до 0,25-0,26 М для выделения карбоксипептидазы В в изокритическом режиме, при концентрации хлорида натрия 0,25-0,26 М для выделения карбоксипептидазы А с последующей повторной ионообменной хроматографией выделенных ферментов в тех же условиях.