Способ определения т @ - лимфоцитов человека

 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа и его упрощение за счет исключения этапа выделения Т-лимфоцитов. У обследуемых людей берут кровь, выделяют лимфоциты и смешивают с эритроцитарным диагностикумом, приготовленным путем сенсибилизации эритроцитов кур с иммуноглобулином человека. Предварительно диагностикум прогревают при 45°С в течение 1 ч. После чего лимфоциты инкубируют с эритроцитами барана. Наличие в крови обследуемых Тγ - лимфоцитов определяют по числу комплексных розеткообразующих клеток. В сравнении с прототипом увеличивается чувствительность на 1,6%. Упрощение способа достигается за счет исключения этапа предварительного выделения Т-лимфоцитов.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (51)5 С 01 М 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4420931/28-14 (22) 04.05.88 (46) 30,04.90. Бюл. Р 16 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней и Алма-Атинский государственный институт усовершенствования врачей (72) И.Г.Цой, Р.С.Идрисова, 6 .И.Крифукс и М.И.Суслова

{53) 615.375 (088.8) (56) Horetta T... Perrarini N., Cooper И.D. — Characterization of

human Т-cell subpopulations as defined by specific receptors for immunoglobulinas. In.: Contemporary Topicsin Immunology, 1978, v 8, р.19-45. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т -ЛИИФОЦИТОВ

ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к медициИзобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа и его упрощение за счет исключения этапа предварительного выделения Т-лимфоцитов, Способ осуществляют следующим образом.

207-ную взвесь тщательно отмытых фосфатным буфером эритроцитов смешивают с 7,27.-ным раствором ацетальдегида рН-7,2 в равных объемах. Смесь инкубируют при комнатной температу- .

„„SU „„1561041

2 не, в частности к клинической иммунологии, Цель изобретения — повышение чувствительности способа и его упрощение за счет исключения этапа выделения Т-лимйоцитов. У обследуемых людей берут кровь, выделяют лимфоциты и смешивают с эритроцитарным диагностикумом, приготовленным путем сенсибилизации эритроцитов кур с иммуноглобулином человека. Предварительно о диагностикум прогревают при 45 С в течение 1 ч, после чего лимфоциты инкубируют с эритроцитами барана.

Наличие в крови обследуемых Тр-лимфоцитов определяют по числу комплексных розеткообразующих клеток. В сравнении с прототипом увеличивается чувствительность на 1,67. Упрощение способа достигается за счет исключения этапа предварительного выделения Тлимф оци т ов .

1m ре в течение 5-7 сут, после чего эритроциты трижды отмывают в фосфат- ф ном 6yhepe и вновь доводят до 207-ной концентрации. Затем один объем 57.-ных фиксированных эритроцитов кур смешивают с тремя объемами раствора нормального иммуноглобулина класса

G(IgG) сыворотки человека в концентрации 80 мг/мл, полученного гельфильтрацией на сефадексе С-50, рП-6,8. Смесь встряхивают и прогревают в водяной бане при 45 С в течение 60 мин. Сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают 0,97.-ным раствором NaCl рН-7,2, содержащим эмбриональную те1561041

4 лячью сыворотку в разведении 1: 300.

0 MblTbIH эритроцитарный диагностикум (8A-реагент) консервируют 0,057 — ным раствором азида натрия.

Лимфоциты, выделенные путем седимЕнтации на одноступенчатом градиенте фйколл-верографина (плотность

1„077 г/мл), доводят до концентрации

2 10 клеток в 1 мл средой № 199.

100 мл клеточной взвеси смешивают со

1()О мкл 17-ной взвеси эритроцитарного д агностикума. Смесь инкубируют

1 мин при 37 С с последующим добавл нием 200 мкл 17-ной взвеси нативо

15 н х эритроцитов барана. Далее смесь цфнтрифугируют при 1000 об/мин в те.чение 5 мин и помещают в холодильную к меру (4-6 С) на 90-120 мин. После окончания инкубации полученный осадок осторожно встряхивают. Подсчет проводят в нативных препаратах под покровн пк стеклом в световом микроскопе (в. 400х), 3а комбинированную розетк принимают лимфоциты, фиксировав е на своей поверхности одновременно б лее двух эритроцитов кур и барана.

Пример 1. Для проверки спец юфичности и точности полученных ре— зультатов по предлагаемому способу нЭ лимфоцитах доноров была проведена серия опытов для доказательства нев1 зможности формирования спонтанных розеток лимфоцитов с фиксированными а 1етальдег щом эритроцитами кур, не и груженными IgG. Результаты опытов показали, что исследуемые эритроциты ( не формируют спонтанных розеток с мо нрнуклеарами периферической крови человека.

Следовательно, при использовании сенсибилизированных IgG — человека эритроцитов кур розеткообразование обусловлено взаимодействием Fc-фрагментов иммуноглобулина класса G c сoотвеTcтB MH рецептора (FсR ) М лИмфоцитов, С целью определения специфичности и. чувствительности предлагаемой тестсистемы для идентификации РсКу лимфоцитов (сенсибилизированные ТяГ эритроциты кур) диагностикум был исп ытан в РПГА микрометодом в 96-луночиых планшетах типа Такачи с исполь зованием моноспецифических антииммуиоглобулиновых сывороток против

Igf u IgG человека (производства ШП1 эпидемиологии и микробиологии имЛ.Ф.Гамалеи) . Результаты проверкипоказали высокую чувствительность и специфичность предлагаемой тестсистемы. Так, титр в РПГА с антиIgG-сывороткой превышал разведение

1:1280, тогда как с анти-ТрИ-сывороткой агглютинация вообще отсутствовала, Пример 2, Специфичность реагирования предлагаемой тест-системы с ГсК лимфоцитами проверялось путем взаимного истощения общего пула лим+ фоцитов от FcR — положительных кле1 ток. Мононуклеары инкубировали с одной тест-системой 15 мин при 37 С, центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин и вновь инкубировали 90 мин при 4 С, + затем освобождали от FcR -клеток путем их седиментации на одноступенF чатом градиенте плотности фиколлверографина (1,077 г/смэ). С мононуклеарами, собранными из интерфазы, ставили реакцию FA-розеткообразования с известной тест-системой.

После истощения общего пула мононуклеаров от FcR -клеток как с помощью известной, так и предлагаемой тест-систем дьполнительные,розетки практически не выявлялись (лимфоциты, присоединившие к своей поверхности более 3 эритроцитов, встречались в единичных случаях).

Разработанный стабилизированный

ЕА-реагент выявлял большее количест-t во FcRy -мононуклеаров, гогда как после взаимодействия лимфоцитов с

ЕА-реагентом известного способа определялось еще некоторое количество

ГсКу на клетках при использовании разработанного .ГА-реагента (2,2

«+0,4Х, впервой серии опытов — 0,6+

+0,2Х, р/0,001),т.е. чувствительность была на 162 выше предлагаемого реагента в сравнении с известным.

Следовательно, предлагаемый ЕА-реагент обладал более высокой чувстви тельностью и специфичностью при идентификации РсКу на мононуклеарах периферической крови человека.

Кроме того, предлагаемый способ проще в сравнении с прототипом за счет исключения этапа предварительного выделения Т-лимфоцитов.

Формула из обретения

Способ определения Т -лимфоцитов человека, включающий забор крови, выделение лимфоцитов, инкубацию их

Составитель В.Литовченко

Техред М.яндык Корректор Л.Патай

Редактор M.Áàíäóðà

Тираж 509

Заказ 976

П од пи с н ое

ВНИИПИ Гасударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîö, ул. Гагарина, 101 в присутствии эритроцитов барана и иммуноглобулинового эритроцитарн го диагностикума и по количеству комбинированных розеткообразующих клеток определяют Тт-лимфоциты, о т л и ч а в шийся тем, что, ./ с целью повьппения чувствительности

1561041 6 способа и его упрощения за счет исо- ключения этапа выделения Т-лимфоцитов, в качестве эритроцитарного диагностикума используют эритроциты кур, сенсибилизированные иммуноглобулином человека, и добавляют его перед инкубацией с эритроцитами барана.