Штамм м-вируса картофеля для производства диагностической сыворотки

 

Изобретение относится к фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике, и представляет собой штамм М-вируса картофеля для производства диагностической сыворотки к этому вирусу. Целью изобретения является получение нового штамма М-вируса картофеля, обладающего более высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностической сыворотки к М-вирусу картофеля, реагирующей с различными штаммами М-вируса картофеля и не дающей реакцией с М-вирусом картофеля. Штамм м-вируса картофеля выделен из растений картофеля. Ему присвоен номер М-35. Штамм М-вируса картофеля М-35 депонирован в коллекции ВИЗРа под номером 16. Титр диагностической сыворотки, полученной с использованием антигена, приготовленного на основе штамма М-вируса картофеля ВИЗР N16, составляет 1:2048-1:4096, а титр сыворотки, полученной с использованием антигена, приготовленного на основе известного штамма, составляет 1:2560. 3 табл.

СОВХОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 1 !

> с 3.

=,„ г-,П1Ы. » 1 (=,;,а

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTGPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4469127/30-13 (22) 29. 07. 88 (46) 07. 10.90. Вюп. 1(37 (7 1) Украинский научно-исследовательский институт. сельскохозяйственной микробиологии (72) Л.П.Коломиец, Ф.Е.Козар, Л.Н .Лебедь и Н.А.Погорилько (53) 576.8(088.8) (56) Вирусные болезни и семеноводство картофеля./Под ред. Ю.И.Власова.—

М.: 1976, с. 98-100, 146-!49. ! (54) ШТАММ М-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ (57) Изобретение относится к фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике, и представляет. собой штамм . М-вируса картофеля для производства диагностической сыворотки к этому

Изобретение относится к фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике, и представляет собой новый штамм М-вируса картофеля для производства диагностической сыворотки к этому вирусу.

Целью изобретения является получение нового штамма М-вируса картофеля, обладающего более высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностической сыворотки к M-вирусу картофеля, реагирующей с различными штаммами N-Dèðóñà картофеля и не дающей реакцией с S-вирусом картофеля. (51)5 С 12 N 7/00, А 01 N 63/00

2 вирусу. Целью изобретения является получение штамма-il-вируса картофеля, обладающего более высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностической сыворотки к

М-вирусу картофеля, реагирующей с различными штаммами Г1-вируса картофеля и не дающей реакций с М-вирусом картофеля. Штамм М-вируса картофеля выделен из растений картофеля. Ему присвоен номер М-35. Штамм М-вируса картофеля М-35 депонирован в коллекции ВИЗРа под номером 16. Титр диагностической сыворотки, полученной с использованием антигена, приготовленного на основе штамма М-вируса кар тофеля ВИЗР N - 16 составляет 1:2048

1:4096, а титр сыворотки, полученной с использованием антигена, приготовленного на основе известного штамма, составляет 1:2560. 3 табл.

Штамм М-вируса картофеля выделен из растений -картофеля сорта Прима.

Монолинии вируса получены пассированием через некроз на листьях мари стенной с последующим наполнением на томатах сорта Петито.

Вновь выделенному штамму присвоен номер М-35. Штамм депонирован в коллекции ВИЗР под Р 16. г

Штамм М-вируса картофеля ВИЗР (11 16/M-35) имеет следующую характеристику.

Штамм имеет нитевидные частицы размером 650"12 нм, температурная точка инактивации 73 С, предельное

1597389 разведение сока 10 з, длительность сохранения инфекционности при 20-22 С составляет 3 дня °

Штамм M-35 идентифицирован как

5 среднепатогенный по реакции, вызываемой им на растениях-индикаторах, влиянию на растения картофеля и на урожай картофеля, степени повышения урон- ня активности РНКазы в соке листьев инфицированных растений томатов.

Штамм М-35 M-вируса картофеля вызывает преходящее просветление жилок листьев, мозаику, а затем слабое закручивание листьев и морщинистость на растениях картофеля. Снижает урожай картофеля на 8-10% по сравнению со здоровым контролем.

Штамм М-35 вызывает повышение уровня активности РНКазы в соке лис- 20 тьев инфицированных растений томатов

va 12% по сравнению с соком листьев неинокулированных контрольных растений (слабопатогенный штамм — на 3,07,5%, сильнопатогенный — на 16,3/).

Активность РНКазы определяют в соке листьев растений картофеля, выращенных.из клубней от здоровых и инфицированных вирусом растений. Повышение уровня активности РНКазы в со-3О ке листьев картофеля, выращенного из пораженных M âèðóñîì клубней, наиболее выражено в фазе бутонизации цветения растений.

Дагпгые спектрофотометрии при

260 нм: РНКазная активность в соке листьев здорового картофеля (контроль) 0,614 ед. акт., а в соке pac— тений, пораженных штаммом М-35 М-вируса картофеля, 0,704 ед. акт., т.е. отмечается повышение РНКазной активности на 15% по сравнению с безвирусным контролем.

В соке растений томата уровень активности РНКазы определяют в динами- 45 ке развития инфекции. Повышение РНКазной активности начинает проявляться в соке инокулированных М-вирусом растений томата через 8-12 дн. после инокуляции, а наиболее выражено через I9-21 дн. после инокуляции.

Данные спектрофотометрии при длине волны 260 нм: активность РНКазы в, соке листьев здорового растения томата (контроль) 0,678 ед.акт., а в соке

55 листьев пораженного штаммом M-35 растения томата 0,759 ед. акт.

Штамм N-35 не заражает дурман обыкновенный (Datura stramonium е .), вызывает локальную реакцию на листьях мари стенной (Сnenopodium muzale L.), гомфрены головчатой (Gomphrena globosa L.), вар. пурпурно-цветущей; системно вызывает мозаику на растениях паслена полегающего (Solanum demissum Lindl), морщинистость и бронзовость листьев чилийских томатов (Licopersicon chilense Dun.) в условиях климатической камеры (22 С, 15000 лк.). Растения томата различных сортов (Lycopersicon esculenthum Mil.) являются бессимптомными носителями вируса.

Штамм М-35 М-вируса картофеля легко передается способом механической инокуляции на растения картофеля, томата и др.

Штамм в лаборатории поддерживают в растениях картофеля, которые выращивают в изолированных условиях, а также в пробирочной культуре растений картофеля сорта Приекульский ранний.

По сравнению с другими штаммами

М-вируса картофеля штамм Y-35 обладает более высокой иммуногенностью, полученная к этому штамму сыворотка высоко специфична и активна.

H p и м е р 1. Использование штамма для накопления вируса.

Растения томатов в фазе 2-3 листьев заражают вирусом, используя для заражения сок листьев картофеля, инфицированного штаммом М-35 М-вируса картофеля.

Для приготовления инокулюма листьев пораженных растений их растирают в фарфоровой ступке с добавлением

0,1 M фосфатного или цитратного буферного раствора (рН 7,4) в пропорции 1:1-1:10. Полученную вируссодержащую суспензию наносят на листья заражаемых растений с помошью поро-. лонового тампона .после предварительного опудривания их мелкозернистым карборундом.

Штамм М-35 отличается высокой эффективностью механической передачи:

83,0% — на растения картофеля сорта

Приекульский ранний, 100% — на растения томата сорта Советский, Украинец, Невский, Rutgers, Petito.

В растениях томата штамм M-35 накапливается с высокой концентрацией (значение титра составляет 1:64

1:128) и достигает максимальной концентрации в листьях .среднего яруса через 19-25 дн, после заражения.

5 15

Концентрацию вируса в соке пора" женных растений определяют путем постановки реакции капелькой агглютинации с гомологичной антисывороткой. Показатель концентрации вируса в соке инфицированного растения (титр) — это предельное разведение сока, при котором наблюдают положительную реакцию.

Штамм М-35 не оказывает угнетающего действия на растения томата, Эти свойства штамма позволяют получить большое количество зеленой массы при высокой концентрации вируса.

Пример 2. Использование штам ма М-35 М-вируса картофеля в качестве антигена.

Листья томатов, инфицированных штаммом.M-35, собирают, охлаждают в холодильнике и измельчают на мясорубке, вирус экстрагируют в рабочем буферном растворе, обладающем стабилизирующими свойствами (0,05 M натрий лимонно-кислый трехзамещенный, 0,007 M трилон Б и 0,2Х сульфита натрия). Инфекционный сок осветляют путем кратковременного (5-6 мин) эмульгирования с охлажденным хлороформом и низкоскоростного центрифугирования в течение 20 мин при 3500 об/мин. Дальней-. шую очистку вируса проводят путем гель-фильтрации на хроматографических колонках, заполненных гелями на декстрановой основе (молселекты Г-50 и ЛЭАЭ-50). Концентрируют вирус

3,17-ным полиэтиленгликолем (ПЭГ

15000) в присутствии 0,25 M хлористого натрия. После выдерживаиия вирусного антигена в холодильнике в течение 1 ч проводят центрифугирование в течение 20 мин при 4000- об/мин.

Осадок ресуспендируют в 0,1 ч. исходного объема физиологическим раствором. На всех этапах очистки наличие вируса контролируют серологическим методом.

Антиген, полученный при очистке растительного материала, инфицированного штаммом М-35 М-вируса картофеля, отвечает основным требованиям.

Чистоту препарата определяют,используя серологический, электронномикроскопический, спектрофотометрический методы.

Полученный антигей в реакции капельной агглютинации реагирует только с гомологичной сывороткой и не реагирует с гетерологичными сыворотками, 97389

55 в том числе, и с сывороткой к М-вирусу картофеля., Электронная микроскопия нативных препаратов полученного антигена показала характерные для М-вируса картофеля частицы размером 650 12 нм и не показала посторонних примесей.

При спектрофотометрии очищенного препарата в интервале длин волн от

220 до 280 нм наблюдается характерная для вируса кривая с максимумом при 260 нм и минимумом при 240 нм.

При этом соотношение показателей

А260 нм/А280 нм составляет 1,4-1,5, что также характеризует полученный препарат как чистый, не содержащий примесей растительного белка.

Концентрацию вируса в препарате определяют спектрофотометрическим методом, получая О, 1-0, 2 мг/мл.

При иммунизации кроликов в проиэводственныхусловиях используют для инъекции полученный препарат вирусного антигена, разведенный до концентрации 100-500 мкг/мл.

Пример 3. Использование антигена для получения диагностической сыворотки.

Иммунизацию проводят по схеме: две внутримышечных инъекции по 2,5 мл с интервалом 1 нед. и четыре внутривенных инъекций с интервалом 1 дн по

1; 3; 3 и 3 мл антигена. Кровь отбирают на 7-й, 9-й и 11 — и день после последнего введения антигена. При получении штаммоспецифических сывороток применяют одну инъекцию антигена внутривенно.

Получают сыворотку крови по известной методике.

После получения сыворотки определяют ее титр и специфичность отдельно по кроликам с гомологичными и гетерологичными (Х, S, Y, F) вирусами картофеля, а также с растительным соком, полученным из здоровых растений картофеля и томатов.

Для определения антигенных свойств сравнивают три штамма M-вируса картофеля: слабопатогенный М-139 (ВИЗР 17), сильнопатогенный М-200 (ВИЗР 14) и среднепатогенный М-35, получая к ним штаммоспецифические и моноштаммовые сыворотки (табл. 1).

Таким образом, использование штамма М-35 позволяет получить антисыворотку к М-вирусу картофеля, отличаю1597389

Т а блица 1

Штамм M Hèðócà картофеля

Титр антисыворотки штаммоспецифической моноштаммовой

М-35

М-139

М-200

М-128

М-117

1: 128

1:64

1:32

1:64

1:64

1:2048

1:2024

1:512 щуюся более высоким титром и специфичностью, по сравнению с приготовленными к другим штаммам М-вируса картофеля.

Моноштаммовые сыворотки, полученные с использованием штаммов М-35 и

M-200 нысокоспецифичны: не реагируют с соком здоровых растений картофеля и томатов, а также с гетерологичными вирусами, в том числе и с

S-вирусом картофеля, как нативные, так и в разведении 1:1, 1:2 и в рабочем разведении. Сыворотка, полученная с использованием штамма М-139 не реагирует с соком эдороньгх растений картофеля и томатов, но реагирует в разведении 1:4 с S-вирусом картофеля.

ТиТр антисынороток определяют

20 двумя методами.

Согласно первой методике готовят ряд разведений физиологическим раствором: 2, 4, 8, 16. .. 2," где и может достичь значения до 10-15, на- 25 пример 2 = 1024 или 2 = 32768. Раз" ведения готовят следующим образом.

Берут специальную пластину с лунками, в которые (за исключением первой) заливают один и тот же объем физиологического раствора (по 1мл).

В первую лунку помещают 2 мл нативной сыворотки. Иэ этой лунки берут

1 мл натинной сыворотки и переносят во вторую лунку (с физиологическим раствором), перемешивают, набирают опять 1 мл и переносят в третью лунку и т.д. Таким образом, разведение сыворотки во второй лунке состанляет 1:2, в третьей 1:4 и т.д.

Для определения титра сыворотки ставят реакцию капельной агглютинации на предметньгх стеклах, используя вируссодержащий сок растений и каждое из приготовленных разведений сыворот ки. Стекла выдерживают во влажной камере, реакции читают с помощью бинокулярного микроскопа в темном поле при увеличении в 25 раз °

Согласно второй методике готовят ряд разведений сыворотки в пробирках.

В первую пробирку помещают нативную сыворотку, а но вторую пробирку к

9 мл физиологического раствора добавляют 1 мл нативной сыворотки, получая разведение 1:10. Перемешивают, набирают из этой пробирки 5 мл сыворотки и переносят в соседнюю пробирку, соцержащую 5 мл физиологического раствора, получая разведение

1:20, и т.д.

Значение титра сыворотки при разведении различными способами представлено в табл. 2, Пример 4. Исследуют выявляе- мость М-вируса картофеля, используя моноштаммоные сыворотки, полученные к различным штаммам М-вируса картофеля, и различные иэоляты вируса (табл. 3).

Сыворотка, полученная к пгтамму

М-35, наиболее активно вступает в реакцию с распространенными в природньгх условиях иэолятами N-вируса картофеля, таким образом, штамм М-вируса картофеля M-35 является более специфичными и иммуногенным чем известные штаммы.

Формула изобретения

Штамм М-вируса картофеля ВИЗР У 1.6 для производства диагностической сг норотки.

1597389

Та блица 2

Пробирка (лунка) Титр сыворотки по методу

) 2

Та блица 3

Иэолят М-вируса картофеля реакция с антисыворотками

М-З5 М-139

Контроль

М"200

24

1гг

139

35 гоо

112

287

1ОЗЗ

4084

686

++

+++

+++

++

+++

++

++

+++

+ . +

++

+++

+++

++

++

+++

+++

+++

++

++

++

+++

+++

П р и м е ч а н и е. "-" - отсутствие реакция; "+" — реакция сомнительна, "+" — реакция слабая; "++" н "+++" — реакция- четко выранена.

Составитель Т.Полянская

Техред М.Дидык КорректорС.Шекмар

Редактор И.Дербак

Заказ 3032 Тираж 489 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

164

128

Р!

И1 иг из

И4

И5

РП пз

П4

П5

2

4

6

8

11

12

Нативная

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1: 128

1:256

1:512

1: 1024

1: 2048

1:4096

Нативная

1:10

1:20

1:40

1:80

1: 160

1: 320

1:640

1: 1280

1:2560