Штамм adenovirus canis 2 для изготовления и контроля инактивированной вакцины против аденовироза собак
Изобретение относится к вирусологии, а точнее к изготовлению профилактических препаратов против вирусных заболеваний животных. Целью изобретения является штамм аденовируса собак типа 2, обладающих широким антигенным спектром, более высокой антигенной и биологической активностью в клеточных системах и стабильной вирулентностью для собак. Указанная цель достигается пассажем штамма, выделенного из органов павшей от аденовироза собаки, через организм интактных щенков к первичнотрипсинизированной культуре клеток почек щенят собак. Полученный при этом штамм обладает антигенным родством с известными штаммами аденовирусов и в первичной культуре клеток почек щенят собак накапливается до титра 105,0-5,5 ТЦД50/мл.. При изготовлении вакцины в качестве анактиванта используют формалин, а в качестве адъюванта - гидроокись алюминия. Полученная вакцина обладает высокой иммуногенностью.
Изобретение относится к вирусологии, а точнее к изготовлению профилактических препаратов против вирусных заболеваний животных. Целью изобретения является штамм аденовируса собак типа 2, обладающий широким антигенным спектром, более высокой антигенной и биологической активностью в клеточных системах и стабильной вирулентностью для собак. Поставленная цель достигается получением штамма Маmmaliadenovirus, Adenovirus canis 2, "Ада" продуцента антигена для изготовления и контроля инактивированной вакцины против аденовироза собак. Морфология. Вирионы имеют кубическую симметрию и представляют собой икосаэдры размером 80 нм. Антигенные свойства. Штамм "Ада" обладает антигенным родством с известными штаммами ("Карабаш", "ВГНКИ", "ДК-3", "САВ-2") вируса инфекционного гепатита собак. В реакции нейтрализации в культуре клеток нейтрализует позитивные сыворотки к аденовирусам собак 1 и 2 типов. В реакции диффузионной преципитации в агаровом геле штамм "Ада" с титром инфекционной активности 104,5 ТЦД50/мл и выше активен по отношению сывороток аденовирусов собак 1 и 2 типов. Культуральные свойства. Штамм "Ада" аденовируса собак типа 2 размножается в первично-трипсинизированной культуре клеток почек щенят собак и в перевиваемой культуре клеток МДСК с проявлением цитопатического эффекта: округление и увеличение преломляемости клеток с последующим образованием "гроздей" и отторжением клеток от стекла. На 4-5 сутки после заражения в культуре клеток происходит накопление штамма вируса с титром инфекционной активности до 105,0 ТЦД50/мл. В процессе пассажей в этих клеточных системах инфекционная активность штамма вируса не снижается. В первично-трипсинизированной культуре клеток почек эмбрионнов свиней штамм накапливается с менее высоким титром инфекционной активности (103,0 ТЦД50/мл), цитопатическое действие менее выражено. В процессе 10 пассажей в данной клеточной системе инфекционная активность штамма "Ада" заметно падает. В других первично-трипсинизированных культурах клеток: почек крольчат, фибробластов куриных и перепелиных эмбрионов, а также в перевиваемых культурах клеток свиного происхождения штамм "Ада" не размножается. Безвредность штамма. Штамм аденовируса собак тип 2 ВГНКИ N 5-12 безвреден для белых мышей, кроликов, тхорзофреток. У морских свинок после внутрибрюшинного введения штамма поднимается температура тела. Основные условия хранения штамма. В нативном состоянии штамм хранится при температуре 2-4оС в течение 6 месяцев, в нативном и в лиофилизированном состоянии при температуре 30оС в течение 1 года (срок наблюдения). При температуре 56оС инактивируется через 20 мин. Штамм свободен от посторонних микробных, вирусных и микозных контаминантов. П р и м е р 1. Штамм аденовируса собак ВГНКИ 5-12 "Ада" применяют для изготовления инактивированной вакцины против аденовироза собак. Для репродукции штамма "Ада" используют первично-трипсинизированную культуру клеток почек собак 1-3 месячного возраста. Культуру клеток почек собак готовят общепринятым методом, используя ростовую среду, содержащую 40% 0,5%-ного гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, 25% среды Игла и 25% среды 199, 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотики (пенициллин 100 ед/л и стрептомицин по 10 мг на 1 мл среды). В качестве поддерживающей среды используют среду, содержащую 30% ГЛАЭ и 70% среды 199. Культуру клеток выращивают в стационарных матрасах при температуре 37 
0,5оС в течение 3-4 суток до полного образования монослоя. Вирус получают путем заражения клеток в матрасах со сформировавшимся монослоем штаммом "Ада" в дозе 0,1 ТЦД50/мл на клетку. После заражения культуру клеток выдерживают для адсорбции вируса в течение 1 ч при температуре 37 0,5оС, а затем добавляют поддерживающую среду в объеме 180-200 мл и инкубируют в условиях термостата. О размножении вируса судят по действию на культуру клеток проявляющимся цитопатическим эффектом, который характеризуется набуханием клеток монослоя с последующим образованием округлений их, формированием пустот и скоплений в виде "гроздей винограда". На 5-6 сутки вирус накапливается с титром инфекционной активности 105,5 ТЦД50/мл. Для обеспечения максимального выхода вируса из клеточного субстрата матрасы с содержимым подвергают замораживанию при -40оС и быстрому оттаиванию в водяной бане при 37оС. При изготовлении инактивированной вакцины против аденовирусных инфекций собак используют вирус с титром инфекционной активности 105,0-5,2 ТЦД50/мл. Для инактивации вируса к вируссодержашему материалу добавляют формалин и выдерживают в течение 5 суток при температуре 37 0,5оС, после чего полученную суспензию смешивают с гелем гидроокиси алюминия. Соотношение компонентов в готовой вакцине следующее, мас. Вируссодержащая жидкость штамма М.Adenovirus canis 2 с титром биологической активности 105,0-5,2 ТЦД50/мл 79,7-74,7 Формалин 0,25-0,3 Гидроокись алюминия Остальное П р и м е р 2. Проводят контроль вакцины против аденовирусных инфекций собак на основе штамма аденовируса собак ВГНКИ N 5-12 на макровид, стерильность, безвредность и иммуногенность. Макровид вакцина предоставляет собой опалесцирующую жидкость розового цвета. При отстаивании вакцины на дно флакона выпадает рыхлый осадок, легко разбивающийся при встряхивании в равномерную взвесь. При пересмотре вакцины во флаконах в косопроходящем свете не обнаружено посторонних примесей, плесени, неразбивающихся хлопьев. При проверке в соответствии с Методическими указаниями по бактериологическому контролю стерильности ветеринарных биологических препаратов, утвержденными ГУВ МСХ СССР 03.06.82, полученная вакцина против аденовирусных инфекций плотоядных стерильна. Для проверки вакцины на безвредность используют белых мышей массой 14-16 г, морских свинок массой 300-350 г и 4 интактные собаки в возрасте 3-4 месяцев. Мышам вводят по 0,5 см3, морским свинкам по 3 см3 и щенкам собак 5 см3 препарата. Полученная вакцина безвредна для всех видов животных, так как в течение 21 суток все остались здоровыми. Для проверки вакцины против аденовирусных инфекций на иммуногенность используют животных, прошедших контроль на безвредность. По 4 привитых и непривитых щенков собак заражают интратрахеальным введением 2х105,0 ТЦД50/мл культурального штамма "Ада". В течение последующего наблюдения в течение 1 месяца все непривитые собаки заболели аденовирозом и две из них пали. Все вакцинированные остались клинически здоровыми, при этом в сыворотках крови 70-80% собак, вакцинированных полученной вакциной против аденовироза, образуются вируснейтрализующие антитела против аденовируса собак 1 и 2 типов. П р и м е р 3. Инактивированную вакцину против аденовирусных инфекций собак, приготовленную на основе штамма аденовируса собак 2 "Ада", используют для вакцинации 110 собак в возрасте до 1 года. Животных иммунизируют введением препарата подкожно в дозе 1 и 2 мл. Контролем служат собаки аналогичного возраста, которые вакцинации не подвергались. Оценку эффективности вакцины проводят путем изучения наличия преципитирующих антител к аденовирусу собак типа 1 типа 2 до вакцинации и через 15, 30, 60 и 90 суток после вакцинации а также по изменению эпизоотической ситуации в питомнике. Исследования показывают, что в сыворотках крови вакцинированных собак через 15 дней в разведении 1:2 появляются преципитирующие антитела к аденовирусам собак типа 1 и типа 2. Вируснейтрализующие антитела к обоим типам аденовирусов собак в титре от 1:64 до 1:128 появляются спустя месяц после вакцинации и сохраняются в течение 3 месяцев (срок наблюдения). В сыворотках крови непривитых животных в течение всего периода наблюдения количество вируснейтрализующих антител к аденовирусам собак типов 1 и 2 не превышало 1:8. В течение трехмесячного наблюдения в группе собак, привитых предлагаемой вакциной, по сравнению с контрольными заболеваемость снизилась на 30% а падеж на 50% Таким образом, предложенный штамм аденовируса собак 2 ВГНКИ N 5-12 обладает широким антигенным спектром, обеспечивает образование в сыворотках крови вакцинированных животных вируснейтрализующих и преципитирующих антител к аденовирусам собак 1 и 2 типов; обладает высокой биологической активностью в культуре клеток 105,5 ТЦД50/мл. Использование штамма аденовируса собак 2 "Ада" позволяет в отечественной практике получать эффективную инактивированную вакцину для профилактики аденовирусных инфекций собак, которая необходима для применения в питомниках служебного собаководства и для вакцинации личных собак.
Формула изобретения
Штамм Adenovirus canis 2 ВГНКИ N 5-12 для изготовления и контроля инактивированной вакцины против аденовироза собак.
