Способ определения эндотоксинсвязывающей активности липопротеидов крови

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунодиагностике. Целью изобретения является повышение специфичности и ускорение способа. Из фракции, содержащей ЛВП, готовят последовательные двукратные разведения в 0,01 М карбонат-бикарбонатном буфере (PH=9,5) и вносят в лунки полистироловых плашек. После термостатирования и промывки в каждую лунку добавляют раствор, содержащий эндотоксин. ЛВП и эндотоксин совместно инкубируют и промывают, после чего в лунки вносят конъюгат антител к эндотоксину с пероксидазой. Для выявления связавшегося конъюгата в лунки добавляют субстрат - раствор 0,04% ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буфере (PH=5,0) с добалением 0,012% H<SB POS="POST">2</SB>O<SB POS="POST">2</SB>.Через 10-30 мин реакцию останавливают добавлением в лунки 50% H<SB POS="POST">2</SB>SO<SB POS="POST">4</SB>. Эндоксинсвязывающую активность оценивают по последней лунке, где визуально проявляется желтая окраска или спектрофотометрически регистрируется эндотоксин, и выражают в количестве белка исследуемой фракции, содержащегося в этой лунке.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ю

ГосудАРственныИ комитет

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (si)s G 01 N 33/53

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4334962(30-14 (22) 25.11.87 (46) 23.10.90. Бюл. М 39 (71) Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов (72) В.Г.Лиходед, Н.Н.Козлова, Е.И.Кропачева и А.А.Рудик (53) 612:118.223-083;337 (088.8) (56) 3 infect.Dis., 1985, v. 52, М 1, р. 177—

184. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОТОКСИНСВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЛИПОПРОТЕИДОВ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунодиагностике, Целью изобретения является повышение специфичности и ускорение способа. Из фракции, содержащей ЛВП, готовят последовательные двукратные разведения в 0,01 М карбоИзобретение относится к медицине, а именно к иммунодиагностике.

Цель изобретения — повышение специфичности и ускорение способа определения эндотоксинсвяэывающей активности липопротеидов высокой удельной плотности (ЛВП) плазмы крови.

Выделяют фракцию ЛВП из плазмы или сыворотки крови, фиксируют ее в последовательных разведениях на твердой фазе (иммунологические планшеты), добавляют к каждому разведению постоянное количество эндотоксина и инкубируют с ним. После отмывания связавшийся эндотоксин определяют при помощи антител, коньюгированных с пероксидазой, причем о связывающей активности ЛВП судят по содержанию бел,, Ы2,, 1601582 А1 нат-бикарбонатном буфере (рН = 9,5) и вносят в лунки полистироловых плашек. После термостатирования и промывки в каждую лунку добавляют раствор, содержащий эндотоксин. ЛВП и эндотоксин совместно инкубируют и промывают, после чего в лунки вносят коньюгат антител к эндотоксину с пероксидазой, Для выявления связавшегося коньюгата в лунки добавляют субстрат — раствор 0,04% ортофенилендиамина в 0,05 M цитратном буфере (рН = 5,0) с добавлением

0,012% Н202. Через 10 — 30 мин реакцию останавливают добавлением в лунки 50%

HzS04. Э ндотокси н связы ва ющую активность оценивают по последней лунке, где визуагьно проявляется желтая окраска или спектрофотоматрически регистрируется эндотоксин, и выражают в количестве белка исследуемой фракции, содержащегося в этой лунке. ка в последнем разведении с регистрируемым эндотоксином.

П р и м e p 1. Получение эндотоксина из мутанта Saimoneila minnesota R595, а также получение антител к эндотоксину, коньюгиpQBaHHblx с пероксидазой, можно осуществлять любым известным методом.

К образцу плазмы или сыворотки крови (1,5 — 1,0 мл) добавляют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 до конечной его концентрации 10,5%, Смесь выдерживают при комнатной температуре 15 мин, затем центрифугируют при 2000 g в течение 15 мин и собирают надосадочную жидкость, которая представляет собой фракцию, содержащую ЛВП. По данным реакции пассивной гемагглютинации фракция практически не содержит антител к эндотоксину. В собран1601582

30

/ н и фракции определяют содержание белка

ni) Лоури.

Из фракции, содержащей ЛВП, готовят последовательные двукратные разведения в.; 0,01 M карбонат-бикарбонатном буфере . (рН -9,5) и по 200 мкл каждого разведения вносят в лунки полистироловых плашек.

Плашки выдерживают 3 ч при 37ОС и 18-20 ч ри 4 С, после чего три раза отмывают дисфллированной водой. Затем для связывания свободных участков полистирола в

Лунки добавляют по 200 мкл 1 -ного раствора БСА, выдерживают плашки 3 ч при 7 С и снова отмывают трижды дистиллированной водой.

В каждую лунку вносят по 200 мкл раствора, содержащего 50 мкгlмл эндотоксина и 0,02 M ЗДТА. После добавления эндоток ина плашки выдерживают 1 ч при 37 С и эатем отмывают 3 раза дистиллированной водой с 0,05 7 Tween-20.

В лунки вносят по 200 мкл конъюгата . антител с пероксидазой. После добавления конъюгата плашки инкубируют 1 ч при 37 С, затем 5 раз отмывают дистиллированной водой с 0,05;/ Tween-20.

Для выявления связавшегося конъюгата антител с ферментом в лунки добавляют по

200 мкл субстрата — раствора 0,047 ортофенилендиамина в 0,05 M цитрэтном буфере (рН = 5,0) с добавлением перед использованием 0,0127 H20$, Через 10 — 30 мин реакцию останавливают путем добавления в лунки по 50 мкл 50%-ной H2SQ4. Учет результатов проводят визуально по появлению желтой окраски или спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Зндотоксинсвязывающую активность оценивают по последней лунке, в которой еще регистрируется окрэшивание, более интенсивное, чем в контроле, и выражают в количестве белка фракции ЛВП, содержащегося в лунке. Чем меньше этот показатель, тем выше эндотоксинсвязывающэя активность, Контролем служит первый ряд плашки, в который внесены все ингредиенты, кроме зндотоксинэ.

При изучении 45 здоровых доноров установлено, что среднее значение зндотоксинсвязывг.ощей активности фракции ЛВП равнялось (M +. д) 36,5 + 5,6 мкг белка.

Пример 2. Использовалась кровь 4 доноров, из которой путем центрифугирования были получены образцы плазмы. В каждом из этих образцов эндотоксинсвязывающая активность ЛВП была определена, как описано в примере 1, а также по способу прототипа (т.е. путем добавления к цельной плазме эндотоксина, меченного радиоактивным йодом, в концентрации 50 мкг/мл, инкубации в течение 1 ч при 37 С с последующим выделением фракции ЛВП путем ультрацентрифугирования и определения в ней радиоактивности и содержания белка).

Полученные результаты показали, что по способу прототипа радиоактивно меченный эндотоксин выявляется в разведениях фракции ЛВП, содержащих.не менее

48,2 +-3,9 мкг белка, тогда как предлагаемым способом связанный эндотоксин обнаруживается в разведениях фракции ЛВП, содержащих не менее 32,4 + 4,1 мкг белка (значимость различий р<0,05).

Это доказывает, что в цельной плазме эндотоксин связывается не только с ЛВП, но и с другими компонентами, поэтому часть его теряется при выделении фракции ЛВП.

Более высокая специфичность при предложенном способе по сравнению с прототипом достигается зэ счет связывания эндотоксина с выделенной фракцией ЛВП, Время, затрачиваемое на анализ по способу прототипа, приблизительно в 2 — 2,5 раза больше, чем по предлагаемому способу (3o — 32 ч).

Формула изобретения

Способ определения эндотоксинсвязывающей активности липопротеидов крови путем совместной инкубации биологической пробы с эндотоксином, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения специфичности и ускорения способа, в качестве пробы используют выделенную фракцию липопротеидов, которую фиксируют в последовательных разведениях на твердой фазе, после чего добавляют в каждое разведение одинаковое количество эндотоксина и после инкубации и отмывания связавшийся эндотоксин выявляют при помощи антител, конъюгированных с пероксидазой, причем эндотоксинсвязывающую активность липопротеидов характеризуют содержанием белка в последнем разведении, где еще регистрируется связанный эндотоксин.