Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов

 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано для оценки клеточной иммунной резистентности. Целью изобретения является повышение чувствительности, упрощение и ускорение способа. Способ заключается в том, что предварительно проводят забор крови или исследуемой ткани, которую гомогенизируют в растворе Хенкса при соотношении раствор - ткань 0,20-0,25:100 и затем вносят полученную смесь или нестабилизированную цельную кровь в миграционную камеру, содержащую среду для культивирования клеток. Камера представляет собой две пластиковые поверхности, расположенные параллельно относительно друг друга. Поверх внесенного в камеру образца при соотношении раствор Хенкса - образец 1:0,004-0,006 располагают диск фильтровальной бумаги, инкубируют камеру при 37°С в течение 10-12 ч и учитывают результаты путем обрисовки контуров миграции на камере с последующим перенесением их на кальку, вырезанием, взвешиванием и определением индекса миграции по разнице весов в опыте и контроле. Способ позволяет повысить точность определения и упростить методику.

СОЛИ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

I 51)5 G 01 N ЗЗ 53

ЫИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯИ

IlPH ГКНТ СССР (21) 4456827/30-14 (22) 08.07.88 (46) 30.09.90. Бюл. Р 36 (71) Институт иммунологии (72) Э,A.Èàêàpÿí, И,В.Красильников, В,A.Дроженников и Е.А,Белякова (53) 615.375(088.8) (56) Иммунологические методы/ Под ред, Г.Фримеля. М.: Иедицина„ 1987, с.310. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИГРАЦИОННОЙ

СПОСОБНОСТИ МАКРОФАГОВ И ЛЕЙКОЦИТОВ (57) Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано для оценки клеточной иммунной реэистентности, Целью изобретения является повышение чувствительности, упрощение и ускорение способа, Способ заключа тся в том, что предварительно проводят забор Kpcâè или исследуемой ткани, которую гомогенизиИзобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к оценке клеточной иммунной резистентности.

Целью изобретения явля тся повыше"ние чувстви: ельности, упрощение и ускорение метода определения миграционной способности макрофагов и лимфоцитов, Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно проводят гомогенизацию исследуемой ткани в .растворе

Хенкса при соотношении ткань-раствор

100:0,25-0,20 и вносят полученную

„„BU„„1596252

2 руют в растворе Хенкса при соотноше" > нии раствор-ткань 0,20-0,25: 100 и затем вносят полученную смесь или нестабилизированную цельную кровь в миграционную камеру, содержащую среду для культивирования клеток. Камера представляет собой две пластиковые поверхности, расположенные параллель но относительно друг друга. Поверх внесенного в камеру образца при соотношении раствор Хенкса-образец

1:0,004-0,006 располагают диск фильтровальной бумаги, инкубируют камеру при 37 С 10-12 ч и учитывают результаты путем обрисовки контуров миграции на камере с последующим перенесением их на кальку, вырезанием, взвешиванием и определени м индекса миграции по разнице весов в опыте и контроле. Способ позволяет повысить точность определения и упростить методикуу °

l смесь или нестабилизированную цельную кровь в миграционную камеру, представляющую собой две пластиковые поверхности, параллельно расположенные одна относительно другой с разMelgeHHbIM между ними фильтровальным диском, при этом фпльтровальный диск располагают поверх внесенного в камеру образца при соотношении раствор

Хенкса-образец 1:0,004-0,006, инкубирование проводят 10-12 ч, а учет результатов осуществляют путем обрисовки контуров миграции на кам ре с по-, следующим перен с нием площади мигра1596252 ции на кальку, вырезанием, взвешиванием и определением индекса миграции . по разнице весов в опыте и контроле.

Камерой, в которой проходит реак5 ция, является чашка Петри диаметром

35-40 мм.

Вместо капилляра, широко используемого в беэагаровой модификации, ;впервые предлагается использование 10 диска фильтровальной бумаги, Приготовление гомогената исследуемого органа в минимальном количестве раствора заменяет центрифугирование образца, предусмотренное классической 15

|методикой постановки реакции.

Пример 1, Мьппей линии BALB/С, обоих полов, 12-16 r, однократно интраназально заражали вириояной фракцией PC-вируса, штамм "Long" (10

ЦПД /0,2 мл/гол.). Через десять дней после заражения получали легкие, гомо|генизировали в гомогениэаторе на раст:воре Хенкса в соотношении на 100 мг ,легочной ткани — 0,2 мл раствора. По- 25 лученный гомогенат в объеме.4 мкл наносили на диск фильтровальной бумаги диаметром 6 мм. Пропитанный гомогенатом диск вносили в камеру, приготов. ленную из чашки Петри диаметром 3540 мм, с раствором Хенкса (1 мп), содержащим раствор вирионной фракции

PC"вируса на растворе Хенкса в концентрацич 1О мкг/мн. Камеры (по 3 с антигеном и беэ него) инкубировали при 37 С, 5Х СО 10 ч.

Учет результатов PTMM оценивапи путем просмотра в косых лучах искусственно ro ис точника света на черном фоне зоны миграции, очерчивали начашке Пет40 ри карандашом по стеклу. Очерченный контур миграции переносили на кальку, вырезали и взвешивали на торсионных весах в мг. Результаты РТММ высчитыBBBH по формуле 45

А

ИМ = ----- p

В где ИМ вЂ” индекс миграции;

А — средний вес кальки в опыте 50 (раствор Хенкса с антигеном);

 — средний вес кальки в контроле (раствор Хенкса без анти). гена) °

В данном. случае получены следую- 55 щие pBHHbIB .

- 0,77

15 3

l9,8

Чем меньше индекс миграции, тем выше уровень клеточного иммунного ответа.

Индекс миграции, равный 0,77, ука- зывает на высокий уровень специфической клеточно-опосредованной реакции при интраназальном заражении мышей вирионной фракцией в дозе 10 ЦПД /

0,2 мл/гол.

Пример 2. Мышей заражали интраназально вирионной фракцией PC-вируса в дозе 10 ЦПД /0,2 мп/гол. Через 10 сут-у мышей брали кровь из ретробульбарного синуса глаза в объеме 5 мкл, наносили на фильтровальный диск диаметром 6 мм и помещали в ка-: меру, содержащую 40 мкг конканавалина А (контроль не содержал антчгена). Камеры инкубировали при 37 С, 5Х СО z в течение 11 ч.

Результаты учитывали путем обведения контуров миграции лейкоцитов в косых лучах искусственного источника света На черном фоне.

Обведенные контуры с чашки Петри переносили на кальку, вырезали и взвешивали на торсионных весах в миллиграмах по формуле:

А

ИИ =

В э где ИИ вЂ” индекс миграции;

А — средний вес кальки в опыте (раствор Хенкса с конканавалином А);

 — средний вес кальки в контроле (раствор Хенкса без конкан ав алин а А) .

В предлагаемом примере индекс миграции лейкоцитов составил

14 4

ИИ= — — = 0.72

20,0

Полученные результаты реакции торможения лейкоцитов показ алч воэможность использования неспецифических митогенов (конканавалин А) для определ ения не сп ецифич е с кой актив но сти

Т-системы заражения мышей, Таким образом, предлагаемый метод позволяет за сравнительно непродол жительный период времени определить достоверный индекс миграции макрофа-. гов и лейкоцитов, Результаты,: полученные в класси" ческом варианте и в данной модификации, показали преимущество предлаЮ

Составитель P. Гуменюк

ТехРед М. Дндык Корректор С,Шевкун

Редактор Н.Горват

Заказ 2906 Тираж 511 Подписно е

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская набер д, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101

1596252 6 гаемого способа, заключающееся в том; культивирования, с последующим инкучто на постановит обита аатрачнваетсф,. бированиеи внесенного оправив в привсего 5 -15 мин (в прототипе 30-60 сутствии антигена и беэ него и учетом мнн), а в целом проведение способа - результатов по индексу миграции, о т-! предлагаемы образом занимает 10-12 ч л и ч а ю шийся тем, что, с целью . 5 (в прототипе 22-24 часа), т.е. в 2: .повышения чувствительности, упрощения раза сокращается время, затрачиваемое и ускорения способа, поверх исследуена определение миграционной способ- мого образца располагают фильтровальности клеток. 10 иую бумагу и проводят инкубирование

l0-l2 ч, а учет результатов осуществФ о р м у л а и s о б р е т е н н я ляют путем обрисовки контуров миграСпособ определения миграционной ции на камере с последующим перенесеспособности макрофагов и лейкоцитов нием их на калькур вырезанием, вэвевключающий обработку исследуемой TKR 15 шиванием и определением индекса миг-. ни или крови, внесение их в мигра- рации по разнице масс в опыте и кон ционную камерур сбдержащую среду пля трол„