Штамм бактерий viвriо наrvеyi - продуцент индуцибельной l- лизиндекарбоксилазы

 

Ияобретгние относится к бтютехнопогин, я частности к получению нопого штамма, обладлкцчего пыс1жой L-личинтекарбоксилл тион активностью, и можгт быть ис польяопапо при определении I-личина. Штамм Vibrio har- cyi BKMB-1714 D (107) пылелон in под Японского моря. 11тамм проявляет высокую активность индуиибсгп ной I -лиэипдеклрбоксилп П 11,8-12,5 ед./мг сухом бактериальном биомассы и 44- 59 ед./мг OPJIK.T. Ь1тамм сохраняет активность при хранении его под вазелиновым маслом и в лиофилизированном состоянии. 2 табл. с Ј С С

СОЮЗ СОВЕТСНИК

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19! (111

А1 (>(I) >1 Г, 12 N 9/88, 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASòÎPCÊÎM СВИДКТЕПЬСТВМ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4635418/13 (22) 12.(>1.89 (46) 23.01.91. н»т. >т 3 (71) Вильнк>сскттй гогу.>арстненньн> университет им. Кппсукo(а» Институт биофттэики ((> AH (,(:(.( (72) Л. В. Руэгене, Л. !(.1 пггтятт>тк>с, A.М.Фиш и T.И.Воробьев,> (53) 577.15(088.8) (56) Автсрское сятт; етегтт,ство (:(:(;!

М 1433981, кл. (, 12 N 9/88, 1987.

1>ерецкене (:. И. » г>р. В:ттт>тттттт стимуляторов роста на биоси>ттеэ гтттзттттдexарбокс ил>а эы тt (>»ñ ò I, .ъ с !т т r т с h i,а оп

1 i ?>(Rg 600.Нау нтя г>остижеттття микробиологов — народиому хозя»стпу, ч. 1, Вильнк>с, 1988, с.70-73.

Изобретение относится к биотехнологии и препставляет собой новьттт штамм бактерии, продут(ирук>г(тттт> иттдуцибельную I.-лизингекарбоксилаэу и может быть испольэояг но микроб»ологической промьштгтенностт.кт.

Цель изобретения — ттыявгтс ние бо лее активного ттттаммгт-продуцента индуцибельной I.-лизинг екарбоксила зы

Vibrio harveyi 107 (ВК?1 B1714D), принадлежащего другому систематическому классу.

Штамм существенно отличается от известного тем, то он является строгим галофилом (не растет беэ NaCI) и для получения ферментного экстракта, клетки раэруш,тк>т осмотическим шоком. Штамм Vibrio harveyi 107 выделен из вод Японок<>го моря, Он характеризуется слег ук>щими признаками.

2 (54) (т(ТИ(М !>ЛКТгтРИ!! V(l(RI(> HARWНУТПР(тт(УИВ!(Т ИН>(У((И! И(1 Н(т!! I,-?(ИЗИ((;(ЕКЛРВ(тКГИ.((ЛВ! (57) Изобретен»е относится к бттотехнологии, в частности K полученит» нов огo итамма, облагтак>т»ет о выс»кот>

I.-лизиндекарбоксттло зной пктиттттостькт, и может быть»спольэонапо при определен»и I.-лиз»нп. Штамм Vibrio ?та>в

veyi ВКМВ-1714 D (107) пыдеттетт»э т>од

Японского мори. (, !тгтмтт прои(>гтттет высокук> актив>>ость итц>уттибелт.ной I.-лизи»декпрбоксилаэы 11,8-1?,5 ед./мг сухой бактс рилли»ой биомассbl и 4459 ед. /мг б>елка. (. !тамм сохраттяет активность при хранении его под вазелиновым маслом и в лиофилизированном состоянии. 2 табл.

Морфологические признаки. Правильные слегка изогнутые палочки passeром 0,5-0,8х1,4-?,6 мкм. Капсул, эндоспор или микроцист не о(>разует. Грамотрицательны. В жидкой среде подвижны эа счет наличия одного очехлеттттого полярного жгутика.

Культуральные свойства. Рост бактерий Vibrio harveyi 107 на различных агаризоваттных средах при 30 С после 24 ч культивировании представлены в табл. 1.

На всех агаризованных питательных средах колонии круглые, желтоватскоричневые, прозрачные, блестящие с правильными краями.

Физиологические свойства. Штамм является факультативным анаэробом. о

Оптимальная температура роста ?8-32 Г о

Температурные границы роста 5-7 и

1622394 рн 6,0+0,2

Способ приготовления среды, условия культивирования родуцента и ппределення активности как в примере 1.

Пример 3. Для получения биомассы культуру Vibrio harveyi 107 выращивают на традиционной среде для данного рода слерующего состава, дополнительно добавляя ках индуктор кормовой лизин, г/л:

Пептон 10,0

Кормовой лизин 8,0

NaC1 30,0

ИВБО4 7Н,0 0,5

40-45 С. Восстанавливает нитраты до

-нитритов. Реакция на оксидаэу положительная. Выделяет хитинаэу, амилазу, липазу, желатиназу. ОбЛадает люминесценцией в .сине-.зеленой области спектра. Не способен накапливать поли

$-оксибутират. Растет на синтетической среде, содержащей D-глюкозу и

NHgC1. Усваивает глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, caxaposy, маинот, глицерин. Усваивает пептон, дрожжевой экстракт, а также соли аммония.

Не нуждается в органических факторах роста. Содержит 46 мол.X ГЦ-пар в

ДНК, Хемоорганотороф. Для роста и люминесценции необходимо присутствие в среде ионов натрия. Оптимальная концентрация хлористого натрия 2,5З,ОХ. Признаки штамма устойчивы.

Иузейная культура хранится в пробирках на полужидкой агариэованной среде Егоровой (пример 3) под ва елиновым маслом. Она хорошо сохраняется в течение 2-3 лет. 25

Пример 1. Пля получения инокулята музейную культуру Vibrio harveyi 107 пересевают на питательный агар (ПЛ) с 37, NaC1 в чашки Петри и инкубируют в термостате при 30 С 24 ч.30 о

Оживленную культуру пересевают в пробирку на косяки ПА с ЗХ NaC1 и инкубируют 24 ч при 30 С. Затем культуру заливают 5 мл среды 1 1. Полученную суспенэию клеток засекают в кони- 3> ческие колбы емкостью 250 мл сп 100 мл среды И- 1. Культуру: выращивают 18 ч при 30 С.

Для получения биомассы Vibrio harveyi 107 штамм выращивают на традици- 0 онной среде 11 1 для данного вида, дополнительно добавляя кормовой лизин, как индуктор, г/л:

Пелтон 10,0

Кормовой лизин 8,0

Глюкоза 2,0

Цитрат натрия 0,65

ИаС1 30,0

ИВБО4 7Н О 0,2 (NH<)Z НРО4. О, 5

КН РО, 5,3

Na НРО4. 2,3

Дистиллированная вода До 1 л рН 6,0+0,2

Питательную среру разливают по

500 мл в конические колбы емкостью

750 мл и стерилизуют 30 мин при

0,5 атм. Стерильную питательную среду засевают инокулятом — культурой

V.harveyi 107 в количестве SX (по объему). Выращивание продуцента в

-колбах проводят согласно известным условиям (начальный рн среды 6,0+

+0,2, температура культивирования о

30 С, без встряхивания колб в термостате) до выходе биомассы 0,22 мг/мл питательной среды, Биомассу бактерии отделяют центрифугированием на центрифуге IUIC"3 при 4000 об./мнн в течение 10 мии. Биомассу промывают 3Хным NaC1 и заливают 50 мл 0,1 И фосфатного буфера с рН 5,75 охлажденного до 4"С. В экстракте определяют L-лизинрекарбоксилазную (ЛДК) активность манометрическим методом в аппарате Варбурга.

За ериницу ЛДКактивности принимают такое количество фермента, который при 37 C и рН реакционной смеси 5,75 через 1 мин от субстрата (0,025 Y) отщепляет 1 мколь СО<.

ЛДК-активность выражают единицами в пересчете на 1 мг сухих клеток и в мг белка (специфическая активность), Белок определяют методом Бредфорда.

П р и и е р 2. Для получения биомассы культуру Vibrio harveyi 107 выращивают на традиционной среде для данного вида, дополнительно добавляют как индуктор кормовой лизин, г/л:

Пелтон 10,0

Кормовой лизин 8,0

Глюкоза 3,0

NaC1 30,0

И8БО4 7Н О 0,2 (БН4. . HPoe 0,5

КН РО 4 5,3

Ва НРО4 2,3

Дистиллированная вода Ilo1л °

1622394 6

harveyi 107 отличается от известного в 2,14-2,24 раза большей ИДК-ак« тивиостью в 1 мг сухих клеток. Кро5 ме того время культивирования сокра1 щается на 2 ч. Данное преимущество мо«<ет су<чественно уменьшить себестоимость ферментного препарата при его изготовлении. Фериентный препарат

L-лизиндекарбоксилаэы мо<кет быть использован при определении 1.-личина, Для получения определенного количества фериентного препарата уменьшается число «<ерментаций<, pacxop «apa u электроэнергии, что делает штамм выг годным для прииенения в проиьалленных условиях.

<-Формула изобретения

Т а

Диаметр колонии мм

Среда

Агариэова иная средл

Егоровой (пример 3)

Питательный лглр сухой (гидролизат кильки)+37 ХаС1

Лглриэовзннля полу-. синтетическая среда (пример 2)

Мясо-пептонный бульон + 37. МлС1

1,5-2,0

1,0-1,5

0,8-1,0

0,5-0,6

ЛДК-активность

Время культивирования, ч

Выход бноиас сы, мг/ия

Пример

Итаии на 1 иг белка (специфическая активность) на 1 иг сухих клеток

Escherichia coli

NRF, 600

0,22 5,5т0,35

В лабораторных условиях

Vibria harveyi 107 (ВКИВ-1 714Р) 30,0

0,22

8,0

В про<вш<ленных условиях

2

11,8+0 60 44,4

12, 1тО, 50 59,0

12, 5+О, 57 44,0

0,22

0,22

0,40

Э

П р и и е ч а н и е. Температура культивирования 30 О, рй среды 6,0 0 ° 2.

КН НРО 1,0

Рыбная вь<тя<кка 0,5 л

Водопроводная вода До 1 л рН 6,0+0,2

Способ приготовления питлтельной среды, условия культивирования продуцента, определение активности, как в примере 1.

Предлагаемая культура на известной среде не росла, так как г, ней отсутствует КаС1. Прн добавлении в известную среду 37 ИяС1 культура росла, но выход биомассы и JUlK-активность была ни<ке и составляла

6,75 ед./мг сухих клеток и 21 6 ед./м белка.

В табл.2 приведены длиные о лизи< декарбоксилаэной акт««ности штлмма

Vibrio harveyi 107 и известного Esche-2G

richia co1i MRE >00. Клк видно иэ табл.2, предлагаемый «<тлмм Vibrio

1Птами бактерий Vibrio harveyi ВКИ

В-1714D — продуцент индуцибельной 1.-лизиндеклрбоксиллзы.

l блица 1