Способ очистки белкового токсина бактерий воrdетеllа реrтussis
Изобретение относится к технической биохимии, в частности к препаративному выделению белковых антигенов бактерий рода Bordetella pertus- sis, и может быть использовано в г-ккробиологии, медицине и иммунологии . Целью изобретения является увелз-1чение емкости аффинных сорбентов с одновременным повьппением степени чистоты Еыдапяемых антигенов. Сначала проводят мягкий гидролиз фатунка или гаптоглобина с получением десяаттлрованньгх производных, которые фиксируют на водонерастворимом носителе (органическом или неорганическом ) . Культуральную жидкость бактерий Eordetella pertussis сорбируют на a.-jKbHHHOM сорбенте при рН 6-8, а десорбцию осуществляют либо буферраствором, содержащим хлористый натрий, либо хаотропными агентами, либо карбонатным буфером с рН ,8,3- 1 5 6 .. i ч . п. ф-лы. (П
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУЕЛИН ииЯ <ш 1
gbr r 1 1Л :" р 3
1Й "в - " ""Kkl
ГОСУДАРСТНЕНН 1Й КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 420244?/30-13 (22) 15.04.87 (31) 86.05457 (32) 16.04.86 (33) (46) 15.10.90. Бюл. К 38 (71) Энститю Мерье (FR) (72) Мари-Жозе Бернадетт Жаклин
Кентэн-Мийе и Франсуа Арминжон (FR) (53) 577.15(088.8) (56) Robinson P.I. et аl, Biochim, Biophys, Acta, )971, 242, 659-661.
Патент Великобритании 9 2015531, кл. С 07 С 7/00 1979
/ (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ БЕЛКОВОГО ТОК"
СИНА БАКТЕРИЙ B0PDETFLL< PERTUSSIS (57) Иэобретение относится к техни" ческой биохимии, в частности к пре" паративному вьщелению белковых антиИзобретение относится к технической биохимии и биотехнологии, в частности к препаративному выделению белкового токсина бактерий Bordåtå11à . pertussis и может быть использовано в микробиологии, медицине и иммунологии.
Целью изобретения является повышение эффективности процесса и степени чистоты выделяемого токсина.
Способ осуществляют следующим образом.
Сначала проводят мягкий гидролиз фетуина или гаптоглобина с получением десиалированных производных.
Эти производные затем фиксируют на водонерастворимом носителе (органиче(Ц) С 12 N 11/00, А 61 К 39/10, С 01 N 33/50//(С 12 N 11/00, С 12 В. 1:01) генов бактерий рода Вогде е11а pertussis и может быть использовано в, микробиологии, медицине и иммунологии. Целью изобретения является увеличение емкости аффинных сорбентов с одновременным повьппением степени чистоты выделяемых антигенов. Сначала проводят мягкий гидролиз фетуина или гаптоглобина с получением десиалированных производных, которые фиксируют на водонерастворимом носителе (органическом или неорганическомом), Куль тур аль Кую жидкость бак тери . Bord å е11a per tus s i s сор бируют на аффинном сорбенте при рН 6-8, а десорбцию осуществляют либо буферным раствором, содержащим хлористый нат-,;ий, либо хаотропными агентами, либо карбонатным буфером с рН,8,3-!
j,6,, 1 ч.п.ф-лы. скок или неорганическом) с получени=-м аффинных сорбентов. Эти сорбенты используют для очистки белковых антигенов бактерий Bordetella per—
tUss1s °
При осуществлении способа отделяют токсин pertussi.s, который фиксируется на а.финном носителе, тогда как
F-HA остается в растворе, затем элюируют токсин pertussis с помощью соответствующего элюирующего средства.
Также используют данный способ для очистки обогащенной F-HA-фракции, ч-.обы удалить токсин pertussis который она может содержать, причем этот последний удерживается аффин1600633 ным носителем. Отделив полученный носитель после введения в контакт с ..материалом хроматографии раствора,получают очищенный P-НА-раствор.
Исходным очищаемым раствором может быть надосадочная жидкость куль" туры бактерий рода Вотйе е11а или частично очищенный раствор токсина рехtussis или F-НА.
)O
Для очистки токсина pertussis на аффинном носителе адсорбционной хроматографией используют исходный раствор, рН которого доведено до значения 6-8, предгочтительно 7. Количество используемого носителя адсорбционной хроматографии зависит от начального объема надосадочной жидкости и/или от концентрации токсина pertussis в культуральной среде или во фракции, используемой в качестве исходного продукта. Контакт осуществляется в ванне или в колонке при 2-30 С.
Для элюирования токсина pertussis, 25
Фиксированного на аффинном носителе можно использовать, например, буфер ный раствор, содержащий в достаточной концентрации соли и/или классические хаотропные агенты, например хлорид 30 магния или карбонатный буфер, имеюший молярность более 25 мМ и рН порядка 8,3-11,6, Ф
Способ иллюстируется следующими пример ами.
Пример 1. Очистка токсина
pertussis путем адсорбционной хроматогр афии на сефар оз е 4В- аси алофетуине. 40 а). Адсорбция токсина pertussis на геле.
Обогащенную токсином pertussis фракцию, полученную после центрифу-.гирования и концентрирования бактериальной суспензии Вогйеte11а pertussis (I фаза), культивированной в
Ферментере на 30 л, пропускают через хроматографическую колонку диамет" ром 4 см, содержащую )20 мл носите ля Сефароза-4В, соединенного с асиалофетуином, с расходом б мл/см /ч.
Сефарозу-4В соединяют с асиалофетуином следующим образом. 30 r активированной СЕРГ сефарозы 4В (РЬахmacia) подвергают набуханию в б л
) мМ НС1 в течение около 15 мин, Гель затем промывают 3 раза г.о 6 л 1 мМ
НС1, К гелю добавляют 400 мл раствосодержащего ) мгlмл асиалофетуина„ 0,1 М ЕаНООв и 0,5 М NaC1.
Смесь оставляют реагировать при
+4 С в течение ночи при мягком перемешивании. К смеси добавляют 125 мл
5М раствора этаноламина, рН 8,0, После инкубации при комнатной температуре в течение 4 ч гель последовательно промывают 500 мл 0,1 M буфера на основе ацетата натрия, рН 4,0, содержащего 1М NaC1, затем 500 мл 50 мМ трис-НС1-буфера„ рН 7,5, содержащего
)M NaCl. Этот цикл промывки повторяют три раза.
Гель затем промывают 3 раза по
500 мл 50 мМ трис-НС1-буфера, рН 7 5„ в присутствии консерванта, такого как мертиолят, с концентрацией
)/10000 (об,ч.).
Гель Сефарозы — 4В, соединенный с асиалофетуином, хранят при +4 С в буфере, таком как 50 мМ трис-НС1-буфер, рН 7,5, в присутствии консерванта, например мертиолята.
Используемый в качестве лиганда в адсорбционной хроматографии асиалофетуин получают следуюшим образом.
Водный раствор фетуина (фетуин типа III Сигма) гидролизуют с помощью 0,05 н. Н2804 в течение 1 ч при 80 С. После гидролиза раствор диализуют несколькими объемами дистиллированной воды в течение 24 ч при + 4 С, чтобы удалить свободные сиаловые кислоты. Раствор асиалофетуина может быть концентрирован путем ультрафильтрации с помошью мембран, порог разделения которых равен 10000.
Удаление сиаловых кислот контролируется специфическим колориметрическим определением сиаловых кислот белковой фракции до и после гидроли" за. б). Элюирование токсина.
Гель промывают двумя объемами колонки 50 мМ трис-НС1-буфера, рН 7,5, т.е. вплоть до полного исчезновения
УФ-поглашения при 278 нм, затем одним объемом колонки 50 MM трис-НС1буфера, рН 7,5, содержащего 1 М NaC1.
Токсин pertussis элюируют 400 мл
l00 мМ карбонатного буфера, рН 9,6.
Измеряют оптическую плотность и гемагглютинатную активность фракций, собираемых на выходе из колонны.
Содержашие действующее начало фракции, т.е. обладающие сильной ге5 16006 магглютинатной, не ингибируемой холестеролом активностью, объединяют.
Токсин pertussis затем осаждают на сульфате аммония с конечной концентрацией, соответствующей 70Х-ному насыщению.
Таким образом, очищенный токсин
per tuss1s вызывает сильный лимфоцитоэ и делает восприимчивыми (сенсибилизирует) мышей CFV к гистамину в дозе 0,04 мкг/мьппь. Способность токсина pertussis к образованию кластеров на клетках СНО характеризуется удельной активностью порядка
65000-260000 СРЛмкг.
Результаты физико-химических анализов и биологических активностей (колориметрически определяют возможное содержание загрязнений, ДНК, ДНК, 20 сахара, определяют содержание эндотоксина, проведение электрофореза в среде SDS или в кислой среде и т.д.) подтверждают гомогенность готового препарата, включающего очищенное дей- 25 ствующее начало.
Анализы на содержание токсина pertussis в начальной культуральной надосадочной жидкости и в конечном осадке показывают выход после очистки 30 выше 902.
Пример 2. Очистка токсина
pertussis путем адсорбированной хроматографии на сферосил-DEAE-декстранасиалофетуине. а). Адсорбция токсина на геле адсорбционной хроматографии. рН фракции, полученной после центрифугирования и концентрирования суспензии Bordetella pertussis (фаза 1) доводят до 7 путем добавления 5 н. раствора соляной кислоты. Фракцию пропускают через колонку диаметром
2 см, содержащую 60 мл носителя Сферосил-DEAE-декстран, соединенного с . асиалофетуином, с расходом
60 мл/см /ч.
Сферосил-ВЕРЕ-декстран (носитель, образованный шариками диоксида кремния ХОС 005, покрытыми минимумом 50 сшитого DEAF.-декстрана) соединяют с асиалофетуином следующим образом.
Сферосил-DEAE-декстран подвергают осторожному окислению, чтобы получить альдегидные функции, способные реагировать с а янсгруппами лиганда. Асиалофетуин в виде раствора с концентрацией 4 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, рН 8,0,вводят в
33 б контакт с гелем в течение 15 ч при комнатной температуре. Галь затем промывают следующими растворами .
10 мМ фосфатный буфер, рН 8,0;
20 г/л гликоколь, О,) 7 мМ NaC1
0,05 М цитрат натрия, рН 2,8, О, i нH, НС1. б) . Элюирование токсина pertus8 lз
Гель промывают 120 мл 50 мМ трис-HC1-буфера, рН 7,5, затем 70 мл
50 мМ трис-НСl-буфера, содержащего 1М NaCl Токсин pertussis элюируют 50 мМ трис-НСl-буфером, рН 7,5, содержашим 4N МяС1с. Измеряют оптическую плотность при 288 нм и гемагглютинантную активность собранных H& выходе иэ колонки фракций. Содержащие действующее начало фракции, т,е. обладающие повышенной гемагглютинантной активностью, не ингибируемой холестеролом, объединяют.
Полученную смесь обессоливают путем фильтрации через гель в колонне с Сефадекссм С-25 (7,5 х 45 см, Pharmaciа), уравновешенным с буфером
50 мМ трис-НС1, рН 7,5. Элюирование осуществляют с.помощью того же самого буфера.
Измеряют оптическую плотность при
278 нм и гемагглютинантную активность фракций, собранных на выходе из колонки. Содержащие токсин pertussis фракции, т.е. обладаюшие повышенной гемагглютинантной активностью, объединяют.
Действуюшее начало осаждают на сульфате аммония путем медленного добавления при перемешивании 47 r(NH<) 804 на 100 мп раствора. Анализ биологических и физико-химических свойств показывает, что полученный продукт представляет собой высокосчишеннсе действующее начало.
Пример 3. Удаление следов токсина pertussis из обогащенной
F-HA-фракции.
Способы очистки F-HA включают стадию десорбции Е-НА из хроматографического носителя, например оксиапатита, с помощью 100 мМ фосфатнсго буфера, pH 7,0, содержащего 0,5 М NaC1.
Измеряют оптическую плотность при
278 нм и гемагглютинантную активность фракций, собираемых на выходе из колонки с оксиапатитсм. Фракции, содержашие F-НА, т.е. обладаюшие повышенной гемагглютинантной активно! 600б33 стью и ингиби уемые хслестералом, объединяют.
С целью удаления возможно имек щихся следов токсина pertussis смесь фракций, содержаших F-НА, пропускают через колонку с сефаооза-4В-асиалофетуином. F-НА элюируют непосред— ственно, тогда как возможные следы токсина удерживаются к колонке.
F-HA затем осаждают сульфатом аммония путем добавления медленно и при перемешивании 47 г (NH ) 100 мл раствора. Формула изобретения Составитель В. Рарламова Редактор Т. Лазоренко Техреп Л,Сердюкова Корректор Э 11oH IaKos Заказ 3153 Тираж 507 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/S Производственно-издательский комбинат "Патент",, r,Óæãoðîä, ул. Гагарина,101! Таким образом„очищенный F-НА не вызывает ни лимфоцитоза., ни восприимчивости к гистамину в дозе 100 мкг/мышь. При концентраци 00. мкг/мл. F.-БА не вызывает модификации в клеточ- 20 ном слое„образованном клетками яичника хомяка, т. е. отсутствует об. разование клеточных скоплений (кластеров), характерных для наличия токсина f ertussis Его удельная гемаг- 25 . глютинантная активность, измеренная на эритроцитах гусей, порядка 250000 500000 ед. НА/мг протеина. Эта активность полностью ингибируется холестеролом. 30 Пример 4. Сравнительное изучение способности фиксации токсина pertussis на носителях адсорбционной хроматографии на основе фетуина и асиалофетуина. Гель для адсорбционной хроматсгра-. фии получают путем иммобилизации асиалофетуина на активированной CNBr (Pharmacia) сефароэе-4В согласно способу, описанному в примере 1. 40 П,.;.раллельно аналогичным образом получают гель для адсорбционной хроматографии с фетуином. Фиксацию фетуина и фиксацию асиалофетуина осуществляют в идентичных экспериментальных условиях дпя получения на гелях плотностей сравниваемых лигандов. Каждый эксперимент реализуют параллельно на двух типах носителей, вводят их в контакт с одним и тем же объемом культуральной надосадочной жидкости, содержащей токсин pertussis. Элюированное количество токсина pertussis определяют по анализу протеина и иммуноферментативным методом (К1.ТЯА) . Проводят сравнительное изучение пригодности пдлуче .Iных гелей. Относительная емкость геля, содержащего фетуин, составляет 79% от емкости геля, содержащего асиалофетуин ° 1. Способ очистки белкового токсина бактерий Вогсе е11а pertussis с помощью аффинной хроматографии, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с цепью повышения эффективности процесса и сгепени чистоты выделяемого токсина., используют аффинный сорбент, содержаший стационарный лиганд— десиалированный гликопротеин. ?. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что используют аффинный сорбент, содержаший в качестве десиалированного гликопротеина асиалофетуин или аспалогаптоглобин.
