Штамм бактерий bacillus liснеni fоrмis - продуцент рестриктазы в @ 13i

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма Bacillus lichenlformls ВКПМ В-4722(В-13), продуцирующего рестриктазу с более высоким выходом фермента . Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bli 13 I, которая является изошизомером рестриктазы Ssp. Ml Bli 13 I, узнает последовательность 5LTCCGGA-3 в составе двухцепочечной ДНК. Биомассу штамма выращивают в питательном бульоне на основе гидролизата кильки до поздней логарифмической фазы. Клетки разрушают ультразвуком и рестриктазу получают хроматографической очисткой на биогеле А 05М, ДЕАЕ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе. Выход фермента 5000 ед. на 1 г биомассы. Препарат пригоден для генно-инженерных работ. 1 табл. сл С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ .

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4691191/13 (22) 11.05.89 (46) 23.05,91. Бюл. N 19 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) В.С.Дедков, Н.И.Речкунова и С.Х,Дегтярев (53) 577.15(088.8) (56) Rbberts R,J. Restriction епзуаез and

their isoshisomers. Nucleic АсЫз Res, 1988, 16, 271 — 313, Kita К., Hirotoka N., Oshima А., Kadonishi

S„0bagashi А. Acc. III, a new. restriction, endonuclease from Aclnetobacter

calcoaceticus — Nucleic Acids Res, 1985, 13, 24, р, 8685-8694.

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой штамм, который можно использовать для получения эндонуклеаэы рестрикции (рестриктазы), узнающей последовательность нуклеотидов 5 — ТСС-GGA-3 в составе двухцепочечной ДНК и расщепляющей ДНК в этой области.

Цель изобретения — выявление штамма

Bacillus IichenIformis ВКПМ В-4722 (B 13), продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом.

Штамм бактерий Bacillus llcheniformis

В-13 выделен в результате поиска продуцентов рестриктаз среди микробов воздуха вне помещения.,,Ы2 „1650697 А1 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

LICHENIFORMIS — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ BLI 13 I (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, Цель изобретения— выявление штамма Bacillus lichenlformls

ВКПМ В-4722(В-13), продуцирующего рестриктазу с более высоким выходом фермента, Штамм продуцирует эндонуклеазу рестрикции Bli 13 1, которая является изошизомером рестриктазы Ssp, Mll ВН 13 1, узнает последовательность 5 TCCGGA — 3 в составе двухцепочечной ДНК. Биомассу штамма выращивают в питательном бульоне на основе гидролизата кильки до поздней логарифмической фазы, Клетки разрушают ультразвуком и рестриктазу получают хроматографической очисткой на биогеле А

05М, ДЕАЕ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе, Выход фермента 5000 ед, на 1 г биомассы.

Препарат пригоден для генно-инженерных работ, 1 табл. вюзи

Штамм бактерий Bacillus licheniformis

О имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. В молодой культуре (16 — 18ч) клетки подвижные, палач- О ковидные, небольшие 0,5-0,7 мкм в попе- о речнике и 2 — 4 мкм в длину. Располагаются 4 поодиночке, парами, Споры эллиптические

0,6 х 1 мкм. Отчетливой раздутости спорангия нет. Грамположительные.

° евай

Ф иэиолого-биохимические признаки.

Факультативный аназроб, каталазоположительный. Аэробно слабо образует кислоту иэ глюкозы, сахарозы, мальтозы, глицерина, маннита, но не иэ арабинозы, сорбита, рамнозы, лактоэы, этанола. Из глюкозы также образует ацетоин, но не газ. Анаэробно иэ

1650697

Параметры

Показатели ля штамма

А. calcoaceticus

В. Iicheniformis

В 13

Число рестриктаз, среди которых надо выделить специфичную К 5 — ТСС GG А-3

Число хроматографий при выделении рестриктазы

Выход очищенного фермента, е ./r биомассы

< 1000

5000

Составитель И,Привалова

Техред М.Моргентал Корректор M,Äåì÷èê

Редактор Н,Гунько

Заказ 1583 Тираж 374 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 глюкозы образуют кислоту, Гидролиэует крахмал, казеин, желатин, твин-80, Дезаминирует аргинин. Сероводород и индол не образует. Восстанавливает нитрат в нитрит.

Чувствителен к ампилициллину, хрорамфениколу, канамицину, стрептомицину, тетрациклину (100 мкг/мл среды 1), Используют глюкозу в качестве единственного источника углерода и энергии для роста, Растет при

10 — 55 С, оптимум 37 С, рН среды 6 — 8, оптимум рН 7,0, концентрация NaCI 0 — 7, оптимум 0,7%. Содержание Г+ Ц в ДНК49% (по плавучей плотности).

Культуральные признаки. Среда 1, питательный агар, г/д: панкреатический гидролизат кильки 17,9; NaCI 5,9; агар

11,2, рН 7 3й 0,1. После 17 ч инкубирования при 37 С образует плоские неправильной формы шероховатые, морщинистые, серые колонии диаметром 1 см и более, часто заполняющие всю поверхность arapa.

Выращивание при 20 С позволяет получить отдельные колонии, которые первоначально круглые, выпуклые, гладкие, блестящие, прозрачные, затем становятся шероховатыми, серыми, неправильной формы, Среда 2, питательный бульон, г/л: гидролиэат кильки 33; NaCI 7, рН 7,2 — 7,4.

При выращивании с интенсивной аэрацией при 37 С штамм дает равномерное помутнение. Среду используют для препаративного выращивания биомассы.

Среда 3, твердая минимальная, г/л: глюкоза 3; НН4ИОз 0,3; KHzPO4 0,1; IizHP04

0,1; Mg 504 0,05; Na CI 0,05; Са СОз 0,5; Fe504

0,0005; агар 15; водопроводная вода. После

50 ч инкубации при 30 С дает плоские колонии неправильной формы. Среду используют для выявления минимальных пищевых потребностей штамма, Пример 1. Выращивание биомассы и выделение рестриктазы ВИ 13 I, Культуру выращивают на среде 2 при

37 С, аэрации 1,5 л/л мин, скорости вращения мешалки 200 об/мин. Когда оптическая плотность культуры достигает 4,5 см при

5 550 нм, клетки осаждают центрифугированием и хранят при — 20 С. Выход биомассы

7,0 г/л, Рестриктазу выделяют по известной схеме, включающей разрушение клеток уль10 траэвуком, гель-фильтрацию на биогеле А

0,5 М, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе. Фермент хранят при—

20 С в буфере с 50 -ным глицерином.

Параметры получения рестриктаз из

15 Bacillus tichenlformis В 13 и Aclnetobacter

caIcoaceticus приведены в таблице.

Пример 2. Определение активности рестриктазы ВИ 13 f, Реакционная смесь в 20 мкл содержит

2Q 0,5 мкг ДНК фага, it 0,05 M трис-HCI (рН 8), 0,2

M NaCI, 0,01 M М9С12. Для определения активности аликвоты фермента 1 — 10 мкл вносят в реакционную смесь, инкубируют при

55 С в течение 1 ч, затем проводят электро25 фореэ в 1 -ном агарозном геле. За единицу активности фермента принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага il в условиях реакции.

30 Таким образом, предлагаемый штамм, по сравнению с известными, обеспечивает повышенный (в 5 раз) выход целевого фермента; продуцирует только одну рестриктазу и позволяет сократить технологически

35 трудоемкие хроматографические стадии очистки (с 5 стадий в известном способе до

3 в предлагаемом).

Формула изобретения

40 Штамм бактерий Bacillus licheniformis

ВКПМ В-4722 — продуцент рестриктазы

Bli 13!.