Способ культивирования ооцитов коров

 

Изобретение относится к области экспериментальной эмбриологии млекопитающих и биотехнологии. Целью изобретения является повышение созревших ооцитов с неповрежденным генетическим аппаратом. Для этого культивирование ооцитов осуществляют одновременно с клетками гранулезы, в культуральной среде ТС-199 с 20% фетальной сыворотки, используя в качестве полипептидного фактора роста мозговой нитритстимулирующий белок в концентрации 100-250 нг/мл. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5оs С 12 Ы 5/00

ГОСУДАРСТВЕН.ЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4393657/13 (22) 18.03.88 (46) 30.06.91. Бюл. М 24 (71) Ленинградский государственный университет (72) В.П. Гончарова, А.К. Голубев, Т.И. Кузьмина, А.В. Романюк, Т.А. Гойло и Б.П. Завертяев (53) 578.085.23(088.8) (56) О. Qospodarowlcz, Н. 8 laleckl, Endocrinology, 1979, ч, 104, М 3, р.р. 757—

764.

Изобретение относится к области экспериментальной эмбриологии млекопитающих и биотехнологии.

Целью изобретения является повышение выхода созревших ооцитов с неповрежденным генетическим аппаратом.

Способ состоит в следующем. Из яичников коров путем надреза фолликулпз (не менее 0,5 мм в диаметре) выделяют ооциты в комплексе с гранулезными клетками и помещают в культуральную среду ТС-199 Hà растворе Хэнкса с гепарином 2 ед/мл и антибиотиками 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 мкг/мл. Промывают ооциты от посторонних клеток в той же среде и помещают во флакончики с теми же компонентами. Затем во флакончики с клетками, находящимися в культуральной среде. добавляют 20 (фетальной сыворотки и мозговой нейритстимулирующий белок в различной концентрации: от 50 до 375 нг/мл. В качестве контроля одновременно в одном опыте берут ооциты и культивируют в той же, Ы2„„1659474 А1 (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ООЦИ.ТОВ КОРОВ (57) Изобретение относится к области экспериментальной эмбриологии млекопитающих и биотехнологии, Целью изобретения является повышение созревших ооцитов с неповрежденным генетическим аппаратом.

Для этого культивирование ооцитов осуществляют одновременно с клетками гранулезы, в культуральной среде ТС-199 с 20 фетальной сыворотки, используя в качестве полипептидного фактора роста мозговой нитритстимулирующий белок в концентрации 100 — 250 нг/мл. 3 табг., среде, но только в присутствии 20 фетальной сыворотки без факторов роста. Флакончики с клетками помещают в термостат для инкубирования при 37 С в атмосфере 57ь

COz; По мере культивирования в течение 30 ч проводят. цитогенетический анализ ооцитов на разных стадиях мейоза, т.е. подсчи- (Л тывают процент созревших и Q дегенерированных ооцитов. Окрашивание и,ф, фиксацию клеток проводят по методу Тарковского. . Дь

Результаты приведены в табл. 1.

Под термином ооциты всегда имеется в виду комплекс ооцитов с гранулезными клетками. Низкий уровень дегенерации ооцитов свидетельствует о благоприятных условиях культивирования клеток.

Пример 1. Через 5 ч культивирования ооцитов в среде ТС-199 с добавлением 200 нг/мл МНСБ, большинство клеток, как в опытной так и в контрольной группах (80 и

85,5 соответственно) находятся на стадии диплотены. Дегенерация в опытной и контральной группах составляет статистически недостоверные величины (26,5 и 27,5%), Пример 2. 81,2% ооцитов в опытной группе через 10 ч культивирования инициировали мейоз, дегенерация при этом составляет 28,1 В контрольной группе 50% . ооцитов на тех же стадиях развиваются, а дегенерация составляет 30%.

Пример 3. Через 15ч культивирования ооциты в опытной группе в основном достигают стадии метафазы I (58,1%), клетки с дегенерированными хромосомами составляют 22,6 против 24,1 в контроле.

Пример 4. 20 ч культивирования ооцитов опытной группы характеризуются синхронным выходом клеток на стадию телофазы — 78,8 и достоверно меньшим числом ооцитов с дегенерированным хромосомным материалом по сравнению с контрольной группой (21,2 против 31,1 в контроле).

Пример 5. Более половины ооцитов опытной группы достигают стадии метафазы II через 25 ч культивирования, в контрольной группе их число достигает 22,6%.

Продолжает оставаться достоверной разница между контрольной и опытной группами по выходу ооцитов с дегенерацией хромосом (11,8% в опыте по сравнению с 22,6 в контроле).

Пример 6. Через 30 ч культивирования

87,9% ооцитов опытной группы находятся на завершающих стадиях развития (телофаэа+метафаза II), в контрольной группе завершают свое созревание 75,7 ооцитов. В контрольной группе зафиксирован высокий уровень клеток с признаками хромосомной дегенерации (43,2 ), в то время как в опытной группе уровень дегенераций продолжает оставаться довольно низким (на уровне исходного состояния популяций ооцитов, поставленных на культивирование — 26,8 против 25% дегенерированного хромосомного материала на 0 ч — начало культивирования). В начале культивирования при выделении ооцитов и в зависимости от техники обработки, чистоты среды и др„часть ооцитов гибнет.

Таким образом, как видно из таблицы, через 25-30 ч культивирования с МНСБ ооциты достигают стадии нуклеарного созревания, т.е. более половины ооцитов достигают стадии метафазы II с низким уровнем хромосомной дегенерации (пример 5, 6) по сравнению с контролем. Дегенерация в конце культивирования в опыте примерно в 2 раза ниже, чем в контроле (через 25-30 ч). Данные по определению разницы между количеством дегенерированных оацитов в начале (на О ) и конце культивирования (абсолютный прирост дегенерированных клеток) свидетельствует о том, что через 30 ч ооциты в 10 раэ меньше дегенерируют в присутствии MM СБ (1,8 в

5 опыте и 18,2% в контроле).

Если после завершения мейоза, т.е. при достижении ооцитами стадии метафазы II (через 30 ч) оставить ооциты в той же среде культивирования до 60 ч, то наблюдается

10 резкое повышение дегенерированных ооцитов в контроле (без МНСБ) по сравнению с ооцитами в среде, содержащей

МНСБ: 75% в контроле и 29,6% в опыте, Этот факт свидетельствует о положитель15 ном влиянии МНСБ на поддержание жизнеспособности клеток ооцитов в культуре.

МНСБ также оказывает положительное влияние на выход биологически полноцен- ных (по состоянию xpQMocoM) ооцитов, син20 хронизацию процесса мейоза, а также позволяет определить время, необходимое для протекания каждой иэ стадий мейоза.

Кроме того, низкий процент дегенерированных ооцитов в присутствии МНСБ свиде25 тельствует также о положительном влиянии

4НСБ на культуру ооцитов, на созревание этих клеток.

В табл, 2 приводятся данные по резуль.татам культивировачия в присутствии

30 МНСБ и без него. В примерах 7 и 8 показаны стадии созревания, процент их созревания (выход созревших ооцитов) и процент дегенерированных ооцитов (по состоянию хромосом), 35 Пример 7, В данном эксперименте через 30 ч культивирования почти все ооциты (88,6 ) достигают завершающей стадии мейоза (метафазы II) в присутствии оптимальной концентрации МНСБ, причем с

40 низким уровнем дегенерации (в 2,3 раза ниже, чем в контроле: 33,9 в контроле по сравнению с 14,8% в присутствии МНСБ), Следует отметить, что на стадии метафазы il большинство клеток в культуре ооцитов ока45 эывается в значительной степени синхронизированной, т.е. большинство клеток находится на стадии метафаэы Il.

Пример 8, Применение а качестве добавки в культуральную среду с ооцитами

50 МНСБ приводит к получению высокого процента выхода созревших ооцитов на завершающих стадиях развития (телофаза+метафаза II) 95,2, что на 15,2 выше по сравнению с контролем (79,6%).

55 Абсолютный прирост дегенерированных клеток в опыте (с МНСБ) примерно в 7 раз ниже, чем в контроле (3% по сравнению с

22 1%)

Пример 9. Мозговой нейритстимулирующий белок, влияние которого изучается

1659474

35

50 на модели ооцитов, выделен из мозга крупного рогатого скота, представляет собой катионный гидрофобный белок с мол,мас.

15000 Д. Биологическая активность МНСБ (нейритостимулирующая) сохраняется при термокислотной обработке. Белок выделен с помощью кислотной экстракции, ультрафильтрации, препаративного электрофореэа, хроматографии на гепаринсефарозе.

Таким образом, помещение ооцитов в комплексе с гранулезными клетками в культуральную среду, а также добавление туда

МНСБ для улучшения условий культивирования в совокупности с цитогенетическим тестированием хромосомного, аппарата клетки, позволяет повысить информацию об уровне качества культивирования и повысить качество культивирования.

В табл. 3 отражены данные экспериментов по влиянию МНСБ в разной концентрации (50 — 375 нгlмл) на созревание ооцитов на стадиях мейоэа. Состояние ооцитов оценивают по проценту созревания и проценту дегенерации ооцитое. В примерах 10 — 17 отражены данные по влиянию разных концен. траций МНСБ на качество культивирования ооцитов.

Пример 10. При культивировании ооцитов в среде без МНСБ через 18 ч культивирования 51,87 ооцитов продвигаются в своем развитии со стадии диплотены на . стадии диакинез метафаэа 1, причем 29,6 клеток имеют признаки дегенерации,.

Пример 11. При введении в культуральнуюсреду75 нг/мл МНСБ,40 ооцитов находятся на стадии диплотены, а в состоянии дегенерации 28,6 клеток.

Пример 12. Применение МНСБ в концентрации 100 нг/мл обеспечивает

94 -ю инициацию мейоза (диакинез+метафаэа 1) и меньшее количество ооцитов с дегенерациями хромосом (15,2 ).

Пример 13. При использовании МНСБ в концентрации 150 нг/мл все ооциты через

18 ч проходят стадию диплотены, а процент дегенерации составляет 16,2;(,.

Пример 14. 95,1 ооцитов вступают в стадии диакинеза и метафазы! через 18 ч культивирования в среде ТС-199 с добавкой

200 нг/мл МНСБ, причем основная часть клеток находится на стадии метафазы 1—

80,5 Число дегенерироеанных клеток в среде с фактором роста почти е 2 раза меньше, чем в контрольной группе (14,6 в опыте по сравнению с 29,6 в контроле).

Пример 15. 96,3 «(» ооцитов продвигаются в своем развитии при концентрации

МНС6 -250 нг/мл, достигнув стадий диакинеза, метафаэы I, анафазы, а количество клеток с дегенерированными хромосомами при этом составляет 14,8 .

Пример 16. Культивирование ооцитов в присутствии 300 нг/мл МНСБ позволяет

97,3 ооцитое достичь стадий диакинеэа и метафазы 1, у 24,3;(, клеток наблюдается дегенерация хромосом, т.е. по выходу ооцитов с признаками дегенераций опытная группа не имеет достоверных различий с контрольной (24,3$ против 29,6 ), Пример 17. Культивирование ооцитов в присутствии 375 нг/мл МНС6 уменьшает процент созревших ооцитов и резко уееличивает процент дегенерироеанных ооцитов

61 B .

Таким образом, концентрация МНСБ

200 нг/мл является оптимальной, так как количество дегенерированных клеток составило лишь 14,6 . Следует отметить, что оценка состояния ооцитов по созревания и дегенерации независима одна от другой, так как под термином созревания ооцитов имеется ввиду только нуклеарное созревание, а дегенерация ооцитое оценивается по самым разным признакам аномалии мейоэа, которые были перечислены ранее.

Формула изобретения

Способ культивирования ооцитов коров, включающий забор фолликулов, выделение иэ них клеток гранулезы с последующим культивированием их в питательной среде с фетальной сывороткой. и полипептидным фактором роста, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения выхода созревших ооцитое с неповрежденным генетическим аппаратом, культивирование клеток гранулезы осуществляют одновременно с ооцитами, а в качестве полипептидного фактора роста используют мозговой нейритстимулирующий белок в концентрации 100-250 нг/мл.

1659474

I ! и о

1 В»

1 N с Ъ

1 ° 1 ! е» «в

«

1 + +

1

1 1

I !

1 ! сЧ с Ъ

° л сЧ М

Я) е» л л

N < сЪ М

a a

° о

00 сч л л

° 00

+ +

О С4Ф 01

Cj g 4 Ж

«4 В» Ц с0

+ +

1 +

1

1

-ь л л

1 сОO

I счм!

I

СО О

-- сЧ

N л ж ж

Э о ф

Д, л

Ф Я

W5t0

Э 0 О

Ъа л а

iО t

N N

Я л л сЧ сЧ сЧ

00 сч а ° О М сЧ ф

I I

ОМЭ

i0 с Ъ М

М с Ъ

1 ! оо сЧ сЧ

1

1

1 -.Ф л л

СЬ Ch

I 1 сссО 10О00 ОО сч N I N N I сч сч сЪ Л

СЧ N

6в clj

Е Cj

Ф ЭН

Z 8н

-т е — М е л

Ф М л а

О СеЪ с Ъ л а со

iО N! в с Ъ М

1

N N

l . с Ъ еО сЪ сЪ

0h C) сЧ ! Ъ Ф л л

Ch

° УЪ

- л в л

N N

l. л в л с!1 О л л ссЪ I

М N л а л О

C) л сЧ

N л л

00 е Ъ 0 " " о ъ! сЧ 1

I -1

-Ф I

t Ch" t!

1

1 МсЧ 1 с Ъ М

I в I

t oo

N сЧ

1 л о м м л л

0 Ф л л °

ОЛ

«- N кв л а л сЧ сЧ

Ch л сЪ л л фо

Ю Ф

Ф

9 о

О сЪ л л

О сЪ

00 ф ль л л

Ch O сЧ л л

1 N! л

1 сО

1 !

1 чо

- л м с Ъ М сЪ сЪ оо

С«Ъ М е ив

N сЧ

1.((ting и

Й

X .I о

Ф

0t w

С4 4

CJ i4

tjt o

Ю щ сЧ в

t0 С4 о в.

Ц

3 о

1

1 !

1 !

1 н з

I! -о л а в а

-О OсЧ

I I + +

t сЪ сЪ ОО е» ° !

О40 ОХ л Ф 00 л л л с!ам 1 со 1

° л

N л л

I м! !Ю ох ох

1 3

1! Ж

С4

"у

° л С0

3 о

Ж С4

Ж Ц

Ю о jc! eФ

Вс О

I Ф Ж

41 Э

1 CCt

tut0

Й t0 о о

О t0

Вс О й

М .Ф

° л Ф

1 СсВ Ф

to<

Х.о r!

Таблица 2

1659474

Влияние .МНСБ на созревание ооцитов коров (культивирование в течение 30 ч, концентрация, МЧСБ 200 нгlмп) Показатель

Контроль

Опыт

Количество ооцитов

Созревшие ооциты на стадиях, 7.: диплотен диакинез метафаз Х анафаз телофаз метафаз II

Дегенерированные ооциты, Х: на0ч

11,8

11 8

33,9 в конце культивирования

14,8

Абсолютный прирост

1Р 4ф дегенерированных клеток, У.

+ 3,0

+22, 1

-Примечание. — Не было обнаружено клеток, " Так же, как и в табл. 1, приведены данные по культивированию ооцитов в.течение 30 ч, но отличия цифровых данных по проценту созревших и дегенерированных ооцитов на стадиях мейоза зависит от состояния исходной популяции.

Разница между количеством дегенерированных ооцитов в начале и конце культивирования.

Таблица 3

Влияние ИНСБ на созревание ооцитов коров (выбор олтимальной концентрации

MHCb, время культивирования 18 часов) Концентра ц я МНСВ, нгlмп

КаничестДегенерированные ооциты, Х

Созревшие ооцнты на стадиях, Х во ооцитов т иета- ана- телофав фаза фаз + метафаза т II диакинез диплотен

2,7

3,7

Примечание. - Клетки не обнаружены, 0

375 27

37

33

37

41

27

37

48,2

45,9

40,0

16 0

4,9

3,7

2,7

41,2

48,2

20,8

28,6

15,2

16,2

14,6

3,7

24,3

3,6

33,3

11,4

78,8

81,1

80,5

88;9

73i 0

58;:8

1,6

1,6

1,6

6,6

88,6

3,4

10,2

3,4

3,4

79,6

29,6

54,1

28,6

15,2

16,2

14,6

14,8

24,3

61,8