Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к вирусу гепатита а человека

 

Изобретение относится к иммунологии и гибридомной технологии и может быть использовано для целей диагностики вируса гепатита А (ВГА). Целью изобретения является создание нового штамма гибридных культивируемых клеток - продуцента моноклональных антител (мон AT) к ВГА человека , обеспечивающего высокий уровень синтеза мон AT. Штамм - продуцент мон AT к нативному ВГА - получен от слияния миеломных клеток Ag 8.653.X63 со спленоцитами мышей линии Batb/c, иммунизированных препаратом нативного ВГА. Слияние проводят при помощи ПЭГ с мол. массой 4000, содержащего 10 об.% диметилсульфоксида в фосфатнобуферном растворе. Клетки штамма культивируют в среде RPMItwo с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой . Продуктивность штамма составляет 10 мкг мл в культуральной жидкости и 5 мг/мл в асцитической жидкости. Клетки продуцируют мон AT, специфичные к ВГА, принадлежащие к G-2a иммуноглобулинам. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 332 Д. Ё

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

В (21) 4679955/13 (22) 21.04.89 (46) 23.06.91. Бюл. N 23 (71) Институт биоорганической химии им.

М,М,Шемякина и Ин.титут полиомиелита и вирусных энцефалитов AMH СССР (72) Н.П.Беркова. Т.А,Насташенко, Ю.Ю,Кусов, О.Г.Шамборант, А.Т.Кожич, М.С.Калаян и В.Т.Иванов (53) 578.085.23(088.8) (56) MacGregor А. et al. J,СИп Micr. — 1984, v,18, М 5, р.1237 — 1243. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS

L — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА А ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к иммунологии и гибридомной технологии и может быть использовано для целей диагностики вируса гепатита А (ВГА). Целью изобретения явИзобретение относится к иммунологии и гибридомной технологии и может быть использовано для целей диагностики вируса гепатита А (ВГА).

Целью изобретения является создание нового штамма гибридных культивируемых клеток — продуцента моноклональных антител к ВГА человека, обеспечивающего высокий уровень синтеза моноклональных антител (мон AT).

Штамм получают при слиянии миеломных мышиных клеток Ag 8.653.Х63 со спленацитами мышей линии Balbic.

Слияние проводят при помощи полиэтиленгликоля мол. массы 4000 с 10 об. 7, диметилсульфоксида.

5U 1657527 А1 (я)5 С 12 N 5/00. С 12 P 21/08 ляется создание нового штамма гибридных культивируемых клеток — продуцента моноклональных антител (мон AT) к ВГА человека, обеспечивающего высокий уровень синтеза мон AT. Штамм — продуцент мон AT к нативному ВГА — получен OT слияния миеломных клеток Ag 8.653,Х63 со спленоцитами мышей линии Batb/с, иммунизированных препаратом нативного ВГА. Слияние проводят при помощи ПЭГ с мол. массой 4000, содержащего 10 об. диметилсульфоксида в фосфатнобуферном растворе. Клетки штамма культивируют в среде ЙРМ(164о с

10 -ной эмбриональной телячьей сывороткой. Продуктивность штамма составляет 10 мкг мл в культуральной жидкости и 5 мг/мл в асцитической жидкости. Клетки продуцируют мон AT, специфичные к ВГА, принадлежащие к G-2а иммуноглобулинам.

Штамм депонирован под номером BCKK(ll)

М 332 Д.

Селекцию гибридных клеток осуществляют на среде, содержащей гипоксантин, Л аминоптерин, тимидин, 4

Штамм клонируют дважды. После вто- Ql рого клонирования практически 100ф, кло- )сь,) нов являются положительными. V

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. юеев

Клетки штамма имеют округлую форму, ядро занимает большую часть клетки.

Культуральные признаки.

При суспенэионном культивировании в среде ЯРМ!м4о с 10 эмбриональной телячьей сыворотки клетки слабо прикреплены к субстрату.

Продуктивность штамма.

1657527

При культивировании 1и vitro штамма

БН-1 концентрация иммуноглобулинов составляет 10 мкг/мл при плотности клеток 1 млн/мл в асцитной жидкости 5 мг/мл. Стабильность продуцирования антител сохра- 5 няется на протяжении 50 пассажей в кул ьтуре.

Характеристика полученного продукта.

Мон AT, продуцируемые штаммом клеток БН-1, используют в качестве сенсибили- 10 зирующих антител при диагностике Bl A методом иммуноферментного анализа.

Штамм перевивается мышам линии

Ва! Ь/с, клетки продуцируют иммуноглобулины 6-2а(определение проводят при помо- 15 щи твердофазного иммуноферментного анализа, в качестве вторичных антител используют кроличьи антитела против различных классов иммуноглобулинов мышей. конъюгированных с пероксидазой хрена). 20

Штамм получил название БН-1 и депонирован под номером BCKK(ll), N 332 Д.

Пример. 1. Получение штамма гибридных клеток БН-1.

Проводят иммунизацию мышей и гиб- 25 ридизацию клеток, Самок мышей линии Balb/с иммунизируют по схеме: 15-й день — 40 нг гепатита вируса А вводят в полном адъюванте Фрейда внутрибрюшинно; 7-й день — 40 нг белка 30 вводят в неполном адъюванте Фрейда внутрибрюшинно; 4,3 и 2-й дни — по 40 нг белка вводят внутрибрюшинно; 0-й день — мышь забивают. Селезенку забирают асептически, переносят в чашку Петри и получают 35 клеточную суспензию. Отмытые средой

ЯРМ1184о 60 млн клеток селезенки смешивают с клетками миеломы в соотношении 1:1, центрифугируют 10 мин (200xg). Надосадочную жидкость осторожно удаляют и к кле- 40 точному осадку по каплям добавляют в течение 1 мин 1 мл 50%,-ного раствора полиэтиленгликоля мол. массы 4000 с 10 об. диметилсульфоксида в эабуференном физиологическом растворе (рН 7,2). Затем в тече- 45 ние 5 мин добавляют 10 мл среды RPMI >wo и в течение еще 10 мин доводят объем среды в пробирке до 50 мл.

Клетки центрифугируют в течение 3 — 5 мин, осторожно удаляют надосадочную 50 жидкость, а к осадку добавляют 50 мл среды

RPMl >wo. содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 1х10 М гипоксантина, 4х10 M аминоптерина, 1,6х10 М тимидина, 20 mM L-глутамина, суспендируют 55 клетки пинетированием и распределяют в

96-луночные плейты по 50х10 клеток в 100 мкл среды в лунки, в которые эа день до гибридизации высаживают мышиные перитонеальные макрофаги (5х10 клеток в лунку). Клоны гибридных клеток становятся заметными через 10-12 дней. Тестирование клонов проводят, когда клоны заполняют лунку на 207ь. Положительные культуры клонируют методом предельного разведения в

96-луночных панелях на фидерном слое перитониальных макрофагов, внося по 30. 300 и 30000 клеток на панель.

Для получения асцитов самкам мышей

Balb/с за 10 — 14 дней до инъекции гибридных клеток внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл пристана.

При введении (2 — 4)х10 гибридных кле6 ток у мышей через 14-20 дней образуется асцит.

Пример 2. Иммуноферментный анализ мон AT БН-1.

Образцы, содержащие антитела (супернатанты клеточных культур либо асцитные жидкости), тестируют методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Лунки 96-луночной панели покрывак т в разведении 1:2000 сыворотки реконвалесцента, содержащей ан гитела к вирусу гепатита А в 0,1 М карбонвтном буфере (рН 9,5) и оставляют на ночь при 20 С, Затем лунки плейты отмывают 0,05 -ным раствором твина-20 в 0,01 M натрийфосфатном буфере, содержащем 0,15 M NaCl (ФСБТ) рН 7,4 и инкубируют с препаратом вируса гепатита А в течение ночи при комнатной температуре, Затем лунки плейт отмывают 3-4 раза

ФСБТ и вносят по 50 мкл препарата, содержащего тестируемые антитела. После инкубации в течение ночИ при комнвтной температуре панель отмывают ФСБТ и обрабатывают раствором кроличьих антимышиных антител, коньюгированных с пероксидазой хрена (50 мкл в лунку; разведение 1:1000; 1 ч при 37 С).

Затем панель тщательно отмывают и вносят 50 мкл раствора ортофенилендиамина (1 мг/мл в 1 -ном цитратном буфере(рН

4,5), содержащем 0,05ь Нг02). Реакцию останавливают добавлением в лунку 50 мкл раствора 2 M серной кислоты.

Пример 3, Определение концентрации БН-1 антител в культуральной и асцитной жидкостях.

В лунки 96-луночной панели вносят по

250 нг кроличьих антител к 3g мыши в 0,05

М бикарбонатном буфере (рН 9,6) и инкубируют 18 ч при 4 С. Затем лунки панели отмывают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1 (, БСА (1 ч, 37 С), После отмывки лунок ФСТБ в них вносят серийные разведения тестируемых образцов, содержащих МкАТ, параллельно с серийными разведениями стандарта нормальных мышиных иммуноглобулинов и инкубируют 1,5 ч при 37 С. За1657527

Составитель А.Маныкин

Техред M.Mîðråíòàë Корректор О.Кундрик

Редактор И.Дербак

Заказ 1689 Тираж 384 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тем лунки панели тщательно отмывают

ФСБТ и обрабатывают раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (50 мкл в лунку, разведение 1:1000, 1 ч при 37 С). После этого панель тщательно отмывают и вносят в лунки по 50 мкл раствора ортофенилендиамина (1 мг/мл) в 1 -ном цитратном буфере (pH 4,5), содержащем 0,05 Н202. Реакцию останавливают добавлением в лунку 50 мкл раствора 2 М серной кислоты. Концентрацию иммуноглобулинов в тестируемых образцах определяют по калибровочной кривой, полученной со стандартами нормальных мышиных иммуноглобулинов.

Пример 4. Получение и очистка мон

AT из культуральной и асцитной жидкости.

Гибридные клетки наращивают в пластиковых матрацах в среде RPMI >sap, содержащей 10 (ЭТС, 300 мг/л l-глутамина, 5х10 М маркаптоэтанола при посевной концентрации Зх10 кл/мл. Максимальная продукция иммуноглобулинов через 5-6 дней составляет 10 мкг/мл, Антитела, находящиеся в культуральной жидкости, осаждают сульфатом аммония (27,7 г на 10 мл культуральной жидкости), промывают 0,2 М сульфатом аммония. Осажден н ые сул ьфатом аммония и отдиализованные против

ФСБТ в течение 1 сут образцы наносят на колонку с ДЕАЕ сефароэой, предварительно уравновешенную буфером (10 мМ трис рН 8,0 иэ расчета 10; г белка на 1 мл ионообменника). Элюируют линейным градиентом

Na CI (от 0 до 300 мМ) 15-20 объемом колонки, Иммуноглобулины элюируются при 0,12 М

5 NaCI, Раствор иммуноглобулинов диалиэуют против забуференного физиологического раствора (рН 7,2). Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореэа в 10 (,-ном

10 полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Для получения иммуноглобулинов из асцитной жидкости гибридные клетки приливают мышам линии

Balb/c. 3a 10 — 14 дней до инъекции клеток

15 мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл пристана.

Яри введении (2-4)х10 клеток через 146

20 дней образуется асцит. После отделения клеток центрифугированием (10 мин, 400xg)

20 асцитную жидкость разбавляют в 4 раза и проводят высаливание, дальнейшую очистку иммуноглобулинов проводят как описано.

Таким образом, получают высокопро25 дуктивный штамм гибридных клеток БН-1, продуцирующий мон AT к вирусу гепатита А человека.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых кле30 ток животных Mus musculus L BCKK(ll) 1Ф

332Д вЂ” продуцент моноклональных антител к вирусу гепатита А человека.