Питательная среда для восстановления после криоконсервации гибридных клеток животных mus мusсulus l. - продуцентов противогриппозных моноклональных антител

 

Изобретение отнасится к гибридомной технологии и могет быть использовано при восстановлении после криоконсервации гибридомних киеток Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при восстановлении после криоконсервации гибридомных клеток животных Mus nusculus L. Цель изобретения - повышение выживаемости клеток при сохранении их продуцирующей способности. Пример, В 1 л коммерческой среды RPMI-1640 добавляют 3,9 мг 2-меркаптоэтанола, 100 мг гентамицина, 4,76 г HEPES, 292 мг L-глутамина, 200 мл эмбриональной коровьей сывсротживотных Mus musculus L. Цель изобретения - повышение выживаемости клеток при сохранении их продуцирующей способности. Для этого к 1 л базовой среды - модифицированной по Фибиху среде RPMI-1640 кроме стандартных добавок (Hepes 4,76 г/л, L - глутамина 292,0 мг/л, 2-меркаптоэтанола 3,9 мг/л, гентамнцина 100,0 мг/л, 20% спчоротки эмбриона крови) добавляют компоненты, г/л: глютамат натрия 170- 340; пируват натрия 50-100; А1Ф-3 Na 1,0-2,0; HA,T H2-2-Na ,0-4,0; Fe(NO) 0,1-0,2, РН среды ;,2-/,1. На примерах шестичувствительных к замораживанию гибридом показано, что они не вьгчиваыт на известной среде, но ыскивают и восстанавливают антител опродукцию на модифицированной среде . На примере семи других гибридом (менее чувствительных) показано, .что они вьокивают на обоих вариантах сред, но на предлагаемой среде раньше формируют монослой. ки и получают базовую среду (модификация по Фибиху). Эту среду эффективно используют для реконсервации гибридом , обладаюшлх низкой чувствительностью к криоповреждениям. Для повышения питательных свойств среды при реконсервации гибридом, отличаюттихся повышенной чувствительностью к криоповреждениям, в нее дополнительно вносят (на 1 л базовой среды), мг: глютамат натрия 170; пируват натрия 50; азотнокислое девятиводное железо 0,1; АДФ-3-натрия 1; о $ (Л о СП -U со со 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

<19) CI1) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

M ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4636315/13 (22) 12.01 .89 (46) 07.06. 91. Бюп. Р 1 (71) Всесоюзный научно-исследонатель— ский институт гриппа и Всесоюзный научно-исследовательский институт разведения и генетики сельскохозяйственных животных .(72) А.В.Ветласенин, В.И.Ершов, О.В.Милованов и О.Г.Карпу-хина (53) 578.1)85. 23(188.8) (56) Фибих Х. Консернирона гие при низкой температур з. — В кн.: Иммунологические методы. /Под ред. Г.Фрилиля. M. Медицина, 1987, с. 3! -32, (54) ПИТАТЕ)11эНАЯ ГРЕДА ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОСЛЕ КРИО KOEIC r .P E3AI II II I Г!!11>Р11 (HE)IX КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ i IJS lII!ЯС01.1 S 1.,—

ПРОДУЦЕНТОВ 1IРОТ111)ОГРИ1 103EIE Ik МОНОКЛОНАЛЬН11Х AHTHTE,JI (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при восстановлении после криоконсервации гибридомных клеток

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при восстановлении после криоконсервации гибридомных клеток животных Mus nusculus L.

Цель изобретения — понышение выживаемости клеток при сохранении их продуцирующей способности.

Пример 1, В 1 л коммерческой среды RPIIL-1641) добавляют 3,9 мг

2-меркаптоэтанола, 1 )() мг гентамицина, 4, 76 r НЕРЕЯ, 292 мг I.-глутамина, 20 ) мл эмбриональной коровьей сывсрот(У ) С 12 P 21 /()8, С 12 N 5/02

2 животных Мин musculus 1. Цель изобретения — повышение ныживаемости клеток при сохранении их продуцирующей способнос1и. Для этого к 1 л базовой среды — модифицированной по Фибиху среде КРИТ-164 ) кроме стандартных добавок (Hepes 4,76 г/л, L — глутамина 292,0 мг/л, 2-меркаптоэтанола

3,9 мг/л, гентамицина 1 )!),О мг/л, 2 )% сыворотки эмбриона крони) добавляют компоненты, г/л: глютамат натрия 170340; пирунат натрия 5i)-IÝ); АДФ-3 Na

1, )-,(); НАД Hz-2-Na 2,0-4, ); Fe(NO>)>" х )Н О 0,1- ),2, рН среды,2 — 7,3.

На примерах шестичувстнительных к замораживанию гибридом показано, что они не вьгкинают на известной среде, но н лжнают и восстанавливают антителопродукцию на модифицированной среде, На примере семи других гибридoM (менее чувствительных) показано, ! то они выживают на обоих вариантах сред, но на предлагаемой среде раньше

Формируют монослой. ки и получают базовую среду (модификация по Фибиху). Эту среду эдфектив" но используют для реконсервации гибридом, обладающих низкой чувствительностью к криоповреждениям.

Для повышения питательных свойств среды при реконсервации гибридом, отличающихся повышенной чувствительностью к криоповрещдениям, в нее дополнительно вносят (на 1 л базовой среды), мг: глютамат натрия 170; пирунат натрия 5(); азотнокислое девятиводное железо 0,1; АДФ-3-натрия 1:

1654338

НАД Н -2-натрия 2. После растворения

2 среду фильтруют и используют для восстановления замороженных гибридом.

Среду используют следующим образом ° Клетки реконсервируемой гибридомы 5/161 хранят в жидком азоте в стеклянных ампулах, среда для замораживания: RPMI-1640 43Х, 7Х диметилсульфоксида и 50Х сыворотки крупного 10 рогатого скота в исходной концентра"

6 ции 1х10 клетки в 1 мл на ампулу.

Клетки раэмораживают в водяной бане при 37 С. Непосредственно после оттаио

1 вакия, для удаления криопротектора, 15 размороженную суспензию центрифуги1 руют 10 мин при 1000 об/мин, осадок ресуспендируют в 1,0 мп охлажденной среды КРИТ-1640 и проводят подсчет жизнеспособных клеток путем окраши- 20 вания 1Х-ным трипановым синим в камере Горяева (доля живых клеток 18K).

Затем клетки разбавляют в известной среде RPMI-1640 и в разработанной среде в равных количествах до конечной концентрации 0,8х10 кл/мл и разливают в 24-луночные пластины с двухдневной культурой макрофагов из брюшной полости мыши. Культивирование проводят при 37оС в атмосфере с 5Х СО . На 30 третий день после размораживания подсчитывают число клеток в лунках и определяют коэффициент прироста. Культивирование осуществляют до формирования монослоя, после чего восстанавли- 35 ваемые клетки переносят в стеклянные матрасы.

Антителопродукцию определяют по наличию в культуральной среде специфических иммуноглобулинов в реакции торможения гемагглютинации или иммунофер" ментным методом с эталонными вирусами гриппа А (Виктория) 3/75.

Полученные результаты показывают, 4 что после оттаивания клеток гибридомы

5/161, они полностью погибают в известной среде к концу 2 сут культивирования. В разработанной среде клетки размножаются до концентрации 1,2 10

50 на третий день (т.е. с коэффициентом прироста, равным 15,0). Формирование мокослоя наблюдают на 3 день культивирования, восстановленные клетки сохраняют способность к продукции антител . Клетки гибридомы 5/37 с низкой криочувствительностью на данной среде в 2 раза скорее образуют монослой.

Пример 2. Готовят среду в соответствии с примером 1, но к 1 л базовой среды добавляют компоненты, мг: глютамат натрия 255; пируват натрия 75; железо азотнокислого девятиводного 0, 15; АДФ-3 натрия 1, 5; НАД к Н -2 натрия 3. После стерилизации рН среды 7,2. Эдфективность аналогична результатам примера 1.

Пример 3. На 1 л базовой среды добавляют компоненты, мг: пируват натрия 100; глютамат натрия 340; же- лезо азотнокислое девятиводное 0,2, АДФ-3-натрия 2; НА3 ° Н -2-натрия 4.

После стерилизации и ультрафильтрации рН среды 7,3. Среда эффективна при восстановлении как мало-, так и высокочувствительных к криоповреждениям гибридных клеток.

Таким образом, культивирование реконсервируемых клеток в модифицированной среде КРИТ-1640 повышает надежность восстановления гибридных клеток с сохранением продукции моноклональных антител и увеличивает интенсивность размножения клеток (ко эффициент прироста увеличивается от

9,0 цо 20,0), а также сокращает сроки формирования монослоя.

Аналогичные результаты получают еще на 11 гибридомах мьппей Низ тизсо1us L. Пять из этих гибридом не вы живают на известной среде, ко выживают и продуцируют монАТ на модифицированной среде ° 1Песть гибридом восстанавливают на обеих средах, но на модифицированной вдвое быстрее формируют моиослой.

Формула изобретения

Питательная среда для восстановления после криоконсервации гибридных клеток животных Иив шозск1ов Ь. продуцентов противогриппозных моноклональных антител, содержащая модифицированную по Фибиху среду КРИТ1640, отличающаяся тем, что, с целью повышения вьвкиваемости клеток при сохранении их продуцирующей способности, oHcL дополнительно содержит глютамат натрия, пируват натрия, АДФ-Э-натрия, НАД Н -2-натрия и железо азотнокислое девятиводное при следующем количественном соотношении компонентов, мг/л:

Глютамат натрия . 170-340

Пируват натрия 50-100

АДФ-3-натрия 1-2

1654338

2-4

091,), 1 л

Составитель Г.Игнатьева

Редактор Н.Гунько Техред Л.Олийнык Корректор М.Самборская

Заказ 1930 Тираж 373 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауыская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

НАД Н -2-натрия

Железо азотнокислое девятиводное

Модифицированная по Фибиху среда

RPNI-1640