Способ определения генетический вариантов каппа-казеина у сельскохозяйственных животных

 

Изобретение относится к области генетики и селекции животных, в частности к молекулярной генетики - к способам определения генетипов животных посредством молекулярно генетических маркеров. Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа. Разработан способ определения генетических вариантов каппа-казеина у с/х животных с помощью полимеразной цепкой реакции, включающий в себя выделение хромосомной ДНК в количестве 0,5-1,0 мкг из клеток крови и использование двух праймеров длиной 23 и 24 нуклеотида, комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих исследуемый участок гена, содержащий полиморфный сайт рестрикции для Hind III и Taq I, проведение амплификации исследуемого участка гена посредством полимеразной цепной реакции с использованием ДНК-полимеразы Thermus thermophilus, обработку ампифицированного участка ДНК рестриктазой Hind III или Tag I и анализ продуктов рестрикции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. По сравнению с известным способом обеспечивается его упрощение 6-7-кратное сокращение длительности и 3,5-кратное снижение стоимости определения генетических вариантов каппа-казеина. у Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY CBNQETEflbCTBY

1 (21) 4672018/13 (22) 31.03.89 (46) 30.06.91. Бюл. М 24 (71) Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова и Всесоюзный научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (72) Г.Е. Сулимова, Г.О. Шайхаев, И.А. Захаров и В.Г, Шевченко (53) 575.224.2.577.2 (088.8) (56) Н. Leveziel, L. Metenier et all. Gene Ceil.

Evoll, 1986, ч 20,2, 247-254, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ КАППАКАЗЕИНА У

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к области генетики и селекции животных, в частности к молекулярной генетики — к способам определения генетипов животных посредством молекулярно генетических маркеров, Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа. Разработан способ определения генетических

Изобретение относится к области генетики и селекции животных, в частности к молекулярной генетике, к способам определения генотипов животных посредством молекулярно-генетических маркеров.

Цель изобретения — упрощение и повышение чувствительности способа.

Для упрощения способа определенИя генетических вариантов каппа-казеина сельскохозяйственных животных по сравнению с известным способом ряд этапов упрощены, а отдельные исключены. Для выявления генетических вариантов приме!

Ж„, 1659488 Al (5g)5 С 12 0 1/68 f вариантов каппа-казеина у c/х животных с помощью полимеразной цепной реакции, включающий в себя выделение хромосомной ДНК в количестве 0,5 — 1,0 мкг из клеток крови и использование двух праймеров длиной 23 и 24 нуклеотида, комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих исследуемый участок гена, содержащий полиморфный сайт рестрикции для

Hind lll u Taq 1, проведение амплификации исследуемого участка гена посредством полимеразной цепной реакции с использованием ДНК-полимеразы Thermus

thermophilus, обработку ампифицированного участка ДНК рестриктазой Hind III или

Tag I и анализ продуктов рестрикции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. По сравнению с известным способом обеспечивается его упрощение 6-7-кратное сокращение длительности и 3,5-кратное снижение стоимости определения генетических вариантов каппа-казеина. няется амплификация участка гена каппаказеина с помощью известной полимераэной цепной реакции (ПЦР) с использованием

ДНК-полимеразы иэ бактериального штамма Thermus Thermophilus и двух праймеров, комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих участок ДНК, содержащий полиморфные сайты для рестриктаз Hind П1 и Tag l, определяющий генетические варианты каппа-казеина с последующим расщеплением амплифицированного участка 4НК длиной 228 п.н. рестриктаэой Hind 1П или Tag f. Появление

1659488 дополнительных полос ДНК длиной 128 и

100 п.н. после расщепления по Hind I I I (Тац !) амплифицированного участка ДНК указывает на существование двух генетических вариантов каппа-казеина типа А и

В в геноме животного, В качестве праймеров используются химически ! ,синтезированные олигонуклеотиды:

SGE23TATCATTTAT GGCCATTGGACLA u

SGO24TTGAGATTCCTGTGTAGTTTGTTC, структура которых была подобрана на основе анализа известной первичной структуры гена каппа-казеина коровы и вариантами, ПДРФ по рестриктазам Hind !!!и Tag I, охарактеризованными в прототипе. Выделение ДНК в прототипе обычно проводится по методу Маниатиса и др„рекомендующем получение препаратов ДН К в больших количествах, порядка 10 — 15 мг, в предлагаемом способе используется метод выделения микроколичеств хромосомной ДНК, описанному Сигнер и др, Рестрикция и злектрофо, рез ДНК проводится общепринятыми

° методами, а последующие этапы в предложенном способе исключены, что позволяет сократить время анализа в 6 — 7 раз, а также снизить стоимость анализа в 3,5 раза, Пример 1. Для проведения ПЦР, основанной на свойстве термофильной

ДН К-полимеразы сохранять ферментативную активность после прогревания до 95—

97 С, синтезируют два праймера химическим способом следующей структуры: SG Е23 5 -TATCATTTATGGCATTGGACCA и SGO 24 3 -TTGAGATTCCTCTGTAGTTTGTTC, комплементарных противоположным цепям

ДНК и фланкирующих участок ДНК гена каппа-каэеина в районе 5-го экзона. Для амплификации составляют инкубационную смесь состава; 100 мкл инкубационной смеси содержат 10 мМ трис-HCI, рН 8,4; 2,5 мМ

MgClz; 50 MM ICI, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, четыре dNTP no

200 мкМ каждого, два праймера, SGE 23 и

SGO 24, по 0,3 мкг каждого и 0,5 — 1,0 мкг хромосомной ДНК животного из клеток крови. Денатурацию ДНК проводят при 9597 С в течение 7 — 10 мин, отжиг праймеров

2 — 3 мин при 55 — 58 С, затем добавляют 2,0—

2,5 ед.акт. ДНК-полимераэы иэ Thermus йеппорЬ!!з и проводят синтез участка ДНК при 68 — 72 С в течение 4 мин. Последующие циклы включат 1 мин при 95-97 С (денатурация), 1 мин при 55 — 58 С (отжиг) и 2 мин при

68 — 72 С (синтез). Для преотвращения конденсации воды добавляют к инкубационной смеси 80-100 мкл вазелинового масла. После 30 циклов амплификации образец инкубируют дополнительно 5-10 мин при

68 — 72 С для полного завершения ПЦР. Амплификацию в заданном режиме проводят на программируемом термостате (Perkin

Elmer-Cetus Qslruments), ДН К из инкубационной среды осаждают эталоном (1/20 объема 5 M ацетата аммония и 2,5 объема холодного 96 -ного этанола). осадок подсушивают и растворяют в 50 мкл буфера ТЕ, рН 7,5 (10 MM трис-НС!, 1 MM ЭДТА). Для анализа амплифицированного участка ДНК проводят рестрикцию по Hind !!!, Для этого отбирают 20 мкл амплифицированного раствора ДНК и добавляют в инкубационную среду с 3 мкл 10-кратного буфера для Hind !!! (50 мМ NaCI, 10 MM трисHCI, рН 75; 10 мМ MgClz; 1 мМ дитиотрейтола и 5 ед. акт.

Hind ill и 7 мкл деионизированной воды, инкубируют 1,0 — 1,5 часа при 37 С и продукты рестрикции анализируют на 8 — 10 полиакриламидном электрофорезе (2-3 ч, 15 — 20 в/см) относительно непорезанного по Hind

ill амплифицированного участка ДНК. В качестве маркера молекулярной массы берут смесь BSp Rl (Hind ill) — фрагментов ДНК плазмиды рВК 322.

Прокрашивание ДНК в геле проводят бромистым зтидием и фотографируют. Действие рестриктаэы Hind !!! приводит к появлению дополнительных полос ДНК или исчезновению полосы, соответствующей амплифицированному участку ДНК.

1) появление двух дополнительных полос длиной 128 и 100 п.н, указывает на наличие в геноме животного генетических вариантов каппа-казеина типа А и В;

2) появление двух дополнительных полос длиной 128 и 100 п.н. и исчезновение исходной полосы длиной 228 п,н. указывает на наличие в геноме животного генетического варианта каппа-казеина типа S;

3) дополнительные полосы не появ уются, а наличие исходной полосы, соответствующей амплифицированному участку ДНК указывает на наличие в геноме животного генетического варианта каппа-казеина типа А;

Использование заявляемого изобретения позволит определять генетические ва. рианты каппа-казеина сельскохозяйственных животных независимо от пола и возраста, в том числе у сам цов и эмбрионов, без применени изотопных методов анализа, исключающег< блот-гибридизацию, снизить стоимость ана лиза в 3,5 раза, сократить время анализа

6-7 раз и повысить чувствительность анализа на порядок.

Ф ор мул а изобретения

Способ определения генетических ва риантов каппа-казеина у сельскохозяйст венных животных, включающий обработку

ЯНК гена каппа-казвина эндонуклеазами

1659488

Составитель Е. Кузнецова

Редактор Л. Герасимов Техред М.Моргентал Корректор Н.Король

Заказ 1821 Тираж 373 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитете по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Hind III u Tag l, с последующим анализом продуктов рестрикции электрофореэом в полиакриламидном геле для выявления дополнительных полос ДНК в rene, указывающих на наличие различных генетических вариантов гена каппа-казеина; о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения и повышения чувствительности способа, перед обработкой ДНК эндонуклеаэами проводят амплификацию.участка того же гена с использованием химически синтезированных праймеров, $ОЕ 23 ТАТСАТТ5 TATGGCCATTGGACCA u SGO 24

ТТОАОАТТССТСТОТАОТТТОТТС и цепной полимеразной реакции, осуществляемой термофильной ДН К полимераэой.