Способ культивирования аденогипофиза куриного зародыша

 

Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к экспериментальной эмбриологии и нейтроэндокринологии. Цель изобретения - обеспечение сохранности тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиза. Эксплантаты аденогипофиза располагают на поверхности пористого субстрата, например мембранного фильтра. Последний накладывают на плот, представляющий собой полиэтиленовый диск толщиной 0,5 - 0,7 мм с отверстием в центре. Нагруженный плот помещают в жидкую питательную среду и культивируют в атмосфере с 5% CO<SB POS="POST">2</SB> в течение 7 - 13 сут со сменой среды через каждые 2-е суток. Способ обеспечивает органотипическое развитие аденогипофизарной ткани и дифференцировку специфических клеток аденогипофиза.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4731152/13 (22) 06.07.89 (46) 07.07.91. Бюл. N 25 (71) Научно-исследовательский институт морфологии человека (72) В.М.Барабанов, С.И.Карпунина и Н.Г.Федцова (53) 578.085.23(088.8) (56) Cell Differ, 1986, ч.19. р.179-185. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АДЕНОГИПОФИЗА КУРИНОГО ЗАРОДЫША (57) Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к экспериментальной эмбриологии и нейтроэндокринологии, Цель изобретения — обеспечение сохранности

Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к экспериментальной эмбриологии и нейроэндокринологии.

Целью изобретения является обеспечение сохранности тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиза.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят жидкую питательную среду по любому известному способу. Подготавливают плоты, предназначенные для удержания эксплантатов на разделе жидкой и газообразной сред во время культивирования. Из гидрофобных материалов наиболее пригодным для изготовления плотов является полиэтилен, обладающий удельной плотностью меньше плотности воды, гидрофобными свойствами и механической прочностью.

Плоты из полиэтилена изготавливают в виде дисков толщиной не менее 0,5 мм; диаметром 8,5 мм, в центре диска просверливают

„„!Ж „„1661 210 тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиза. Эксплантаты аденогипофиза располагают на поверхности пористого субстрата, например мембранного фильтра. Последний накладывают на плот, представляющий собой полиэтиленовый диск толщиной 0,5 — 0,7 мм с отверстием . в центре. Нагруженный плот помещают в жидкую питательную среду и культивируют в атмосфере с 5% COz в течение 7 — 13 сут со сменой среды через каждые 2-е суток. Способ обеспечивает органотипическое развитие аденогипофизарной ткани и дифференцировку специфических клеток аденогипофиза, отверстие диаметром 3,5 — 4мм, противоположные стороны диска обрезают в аиде двух параллельных граней, служащих для захватывания и удержания плота пинцетом. Для повышения плавучести плотов их шлифуют на листе из того же материала. Плоты перед использованием стерилизуют 70 -ным этиловым спиртом, промывают в стерильной дистиллированной воде и высушивают под ультрафиолетовой лампой.

У куриных зародышей в стерильных условиях выделяют аденофипофиз с прилежащей мезенхимой, изолируя его от промежуточного мозга. Сепарирование тканей проводят под микроскопом в среде для культивирования. Эксплантаты в количестве

1 — 3 шт. помещают на пористый субстрат— миллипоровый фильтр размером Зх5 мм (тип

НА, диаметр пор 0,45 мкм). Фильтры с эксплантатами укладывают на плот, нагруженные плоты переносят пинцетом в

1661210

Составитель А, Романченко

Редактор M. Стрельникова Техред M.Моргентал Корректор И. Муска

Заказ 2097 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 культуральные чашки на поверхность питательной среды. В одной пластиковой или стеклянной чашке Петри диаметром 35 — 45 мм, содержащей 3-4 среды, размещают до

7 плотов с эксплантатами, Культивирование тканей проводят при 38 С в атмосфере с 5

СО в течение 7 — 13 сут, среду меняют через каждые 2 суток, Плоты на поверхности жидкой среды группируются в центре чашки Петри, не набухают и не тонут. Культуральная среда по I, " ступает к эксплантатам через центральное атверстие плота и фильтр. Плоты не деформируются при захватывании и переносе их с помощью пинцета, что исключает возможность механического повреждения эксплантатов.

По окончании культивирования плоты отмывают от среды в растворе детергента, шлифуют, промывают дистиллированной водой и хранят в 70 -ном этиловом спирте до повторного использования.

Контроль эффективности способа осуществляют путем гистологического и иммуногистохимического исследований эксплантатов по окончании культивирования, как показано в следующих примерах.

Пример 1. Культивирование проводят по описанному способу, Аденогипофиз выделяют у зародышей кур белый Леггорн на

7-е сутки инкубации. В качестве питательной среды используют культуральную среду

DMEM, содержащую фетальную бычью сыворотку 10ь, куриный эмбриональный экстракт 10, пенициллин 50 ед/мл, стрептомицин 50 мкг/мл. Применяют полиэтиленовые плоты толщиной 0,5 мм. Продолжительность культивирования 9 и 13 сут.

Во всех эксплантатах при гистологическом и иммуногистохимическом исследованиях обнаружено органотипическое развитие ткани в виде разрастаний клеточный тяжей и дифференцировка специфических клеток, 5

40 содержащих соматотропный гормон (СТГ).

В части клеток выявлена экспрессия д -кристаллина, характерная для нормального развития аденогипофиза у куриных зародышей, Пример 2. Культивирование проводят по описанному способу. Зачатки аденогипофиза на стадии кармана Ратке выделяют у зародышей кур белый Леггорн через 4,5 сут: инкубации. Переднюю часть зачатка, включающую презумптивную цефалическую долю аденогипофиэа, используют для эксплантации в органной культуре. Применяют жидкую питательную среду, приготовленную на основе культуральной среды

RPMI 1640 с добавлением 10;4 фетальной бычьей сыворотки и ростстимулирующих реагентов. Для поддерживания эксплантатов на поверхности жидкой среды используют полиэтиленовые плоты толщиной 0,7 мм.

Продолжительность культивирования 7 сут.

Специальное исследование показывает, что при культивировании аденогипофиза зародыша кур происходит органотипическое развитие аденогипофизарной ткани и дифференцировка специфических клеток аленогипофиза, что выявляется различными антисыворотками к пролактину, аденокортикотропному гормону, хориальному гонадотропину человека.

Формула изобретения

Способ культивирования аденогипофиза куриного зародыша, включающий выделение эксплантатов аденогипофиза и культивирование их в жидкой питательной среде,отличающийся тем,что,с целью обеспечения сохранности тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиэа, эксплантаты помещают на пористый субстрат, который располагают на плоту, выполненному из полиэтилена толщиной 0,5 — 0,7 мм, имеющего в центре отверстие.