Штамм гибридных культивируемых клеток животных мusмusсulus l. - продуцент моноклональных антител к р @ - копропорфирину 1.

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в качестве парного проявляющего реагента в иммунофосфоресцентных методах анализа различных антигенных веществ. Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) более высокой специфичности и с более высоким выходом. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей Balb/c, иммунизированных коньюгатом Pd- копропорфирин 1 - альбумин с клетками мышиной миеломы Sp 2/0 - Ад 14. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы, а также in vivo в брюшной полости сингенных мышей. Содержание монАТ в культуральной жидкости на 7-е сут. 100мкг/мл, в асцитной жидкости 10 мг/мл. Секретируемые клетками штамма монАТ класса IgG 1 обладают высокой аффинностью (Kd 4,6 М) по отношению к Pd-копропорфирину 1, а также высокой специфичностью в отношении его связывания. Они на несколько порядков слабее взаимодействуют с другими природными порфиринами, что дает возможность использовать их в иммунофосфоресцентном анализе в модификации порфирин - антипорфирин. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 356Д. tmf fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4697868/13 (22) 30.05.89 (46) 30.06.91. Бюл. М 24 (71) Институт биохимии им. A.Н.Баха (72) М.В.Демчева, Т.В.Чередникова, Д.Б.Папковский, А.П.Савицкий, Г.В.Пономарев и Е.|О.Мантрова (53) 578.085.23 (088.8)

° (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1562353, кл. С 12 N 5/00, 1988. . (54) ШТАММ ГИБРИДНЪ|Х КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L-.ÏÐOÄÓÖÅÍÒ МОНОКЛОНАЛЬН! IX АНТИТЕЛ К Pd-КОПРОПОРФИ- РИНУ1 (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в качестве парного проявляющего реагента в иммунофосфоресцентных методах анализа различных антигенных веществ. Цель изобретения — получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональн ые антитела (монАТ) более высокой специфичности и с

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в качестве парного проявляющего реагента в иммунофосфоресцентных методах анализа различных антигенных веществ.

Цель изобретения — получение штамма гибридомы, продуцирующего монАТ более высокой специфичности и с более высоким выходом.

Штамм получают. следующим способом, Для иммунизации используют конъюгат

Pd-копропорфирина 1 с бычьим сывороточным альбумином, полученный карбодии„„5U„„1659477 А1 (я)5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08 более высоким выходом, Штамм получают

"гибридизацией клеток селезенки мышей

Balb/с, иммунизированных конъюгатом Pdкопропорфирин 1 — альбумин с клетками мышиной миеломы Sp 2/Π— Ag 14. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы, а также in vivo в брюшной полости сингенных мышей. Содержание монАТ в культуральной жидкости на 7-е сут. 100 мкгlмл, в асцитной жидкости

10 мг/мл. Секретируемые клетками штамма монАТ класса IgG 1 обладают высокой аффинностью (t d 4,6 10 М) по отношению к

Pd-копропорфирину 1, а также высокой специфичностью в отношении его связывания.

Они на несколько порядков слабее взаимодействуют с другими природными порфиринами, что дает возможность использовать их в иммунофосфоресцентном анализе в модификации порфирин — антипорфирин.

Штамм депонирован под номером ВСКК(П)

М 356Д. мидным методом. 4-недельных мышей линии Balb/c иммунизируют в течение месяца

3 раза по 30 мкг антигена. При первой инъекции раствор антигена суспендируют в равном объеме адьванта Фрейнда, последующие инъекции проводят без него. Титр антител в сыворотке крови животных, определяемый методом EL! SA, составляет

3000, За 4 дня до слияния мышей иммунизируют раствором антигена в физиологическом растворе. Через 4 дня у мыши извлекают селезенку в стерильных условиях, гомогениэируют в физиологическом растворе, содержащем глюкозу (10%) и оставляют стоять 3 мин. Грубый осадок отбрасывают, а взвесь клеток переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 8 мин при 800 g. Нэдосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора, содержащего глюкозу, снова центрифугируют в тех же условиях. Эту операцию повторяют 2 раза.

Аналогичным образом промывают 3 раза физиологическим раствором мышиные миеломные клетки линии Sp 2/О. После этого селезеночные клетки смешивают с миеломными в соотношении 10:1 и осаждают их центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают и к осадку медленно по каплям добавляют 1 мл 50%-ного г олиэтиленгликоля в физиологическом растворе (содержание диметилсульфоксида

10%), Через 3 мин медленно в течение 5 мин добавляют физиологический раствор, содержащий глюкозу, до объема 50 мл. Клетки осаждают центрифугированием и осадок суспендируют в среде 0МЕМ, содержащей сыворотку крови оленей (10%), 3,5 мМ глютамина, 17,5 мкМ пирувата натрия, 50 мкМ

2-меркаптоэтэнола, 100 мкМ гипоксантина, 16 мкМ тимидина, 0,4 мкМ аминоптерина.

Клетки распределяют в пяти 96-луночных микропланшетах и культивируют и ри 370С в атмосфере 5% С02. Через 5 дней клетки подкармливают, убирая из каждой лунки 50 мкл среды и добавляя 50 мкл свежей.

Через 2 недели после слияния проводят тестирование гибридом на наличие моноклональных антител методом непрямого твердофэзного иммуноферментного анализа, используя для сорбции на полистироловых микропланшетах конъюгат

Pd-копропорфирина с соевым ингибитором трипсинэ, Клетки, положительные по результатам тестирования, помещают в среду, содержащую все указанные выше компонентй за исключением аминоптерина (НТсреда). Клетки наращивают в 24-луночных микропланшетах, часть из них замораживают, э. остальные клонируют в полужидком агаре. Клонирование гибридомы повторяют трижды . Клонированную гибридому прививают мышам Balb/c с целью получения асцитной жидкости.

Полученный штамм гибридных клеток

5Д, 9G, 2F, синтезирующий моноклональные антитела (монАТ) к Pd-копропорфирину, депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии AH

СССР под номером ВСКК(П) В 356Д и характеризуется следующими свойствами.

4Г

Культуральные свойства. Для выращивания штамма используют культуральные флаконы. Во флакон объемом 25 мл в 3 мл среды ДМЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки, 3,5 мМ глютамина, 17,5 мкМ пирувата натрия, засевают 2,5 10 клеток гибридомы 5Д, 9G, 2f и проводят пассажи 1 раз в 4-5 дней с подсчетом клеток. Для получения асцита мышам Ва!Ь/c за 7 дней до введения гибридомных клеток вводят 0.5 мл 2,6

10,14-тетраметилпентадекана в/б. На 7 день штамм клеток иньецируют в/б в количестве 500000 клеток в мышь. Асцитную жидкость отбирают на 10-й день, Объем асцита 5-6 мл. Клетки из асцита перевивают новым мышам в течение 9 пассажей без заметного изменения титра моноклонэльных антител в асцитной жидкости.

Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика штамма: модальное число хромосом 90. Маркерных хромосом не выявлено.

Продуктивность. штамма. Концентрация моноклональных антител в культуральной жидкости на 7-й день культивирования составляет 100 мкг/мл, а в асцитной жидкости

10 — 12 мг/мл при определении методом Лури и методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Криоконсервирование. Клетки штамма (500 тыс,/мл) ресуспендируют в смеси, содержащей 30% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% диметилсульфоксида, 60%

ДМЕМ, при 4 С, затем разливают в пластиковые ампулы и помещают в контейнеры из полиуретана. Контейнеры переносят в холодильник на — 70 С на 24 ч, Затем клетки переносят в жидкий азот нэ длительное хранение. Размораживание производится в водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток 80%.

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела относятся к IgG

1 подклассу иммуноглобулинов. Изоэлектрическая точка по основной полосе соответствуе 6,5.

Аффинную константу определяют следующим образом. В лунках 96-луночного микропланшета из полистирола иммобилизуют аффинно очищенные моноклональные антитела. К ним добавляют одновременно различные концентрации копропорфирина

1 и постоянную концентрацию конъюгата копропорфирина 1 с пероксидазой в ФБРТ.

Конъюгат получают присоединением порфирина к белку с помощью 1-циклогексил-3(2-морйолиноэтил)карбодиимида-и-толуол1659477 сульфоната, Реакционную смесь инкубируют 1 ч при 37 С, затем ее переносят в пробирки и оценивают количество не связавшегося с моноклональными антителами 5 копропорфирина 1 спектрофотометрически, Константа диссоциации равна 4,29 10

М.

Специфичность моноклональных энти- 10 тел оценивают методом твердофазного иммуноферментного анализа в следующей системе, Очищенные методом жидкостной хроматографии высокого давления моноклональные антителэ адсорбируют нэ по- 15 верхности полистирола. Затем к адсорбированным антителам добавляют изменяющиеся концентрации порфиринов и йостоянную концентрацию Pd-копропорфирина 1, меченного пероксидазой (1,56 10 20

М) в ФБРТ. Различные порфирины раститровываютот10 до10 М, а белковые коньюгаты порфирина от 10 до 10 M. В качестве контроля служат лунки с Pd (2+)копропорфиринпероксидаэой и буфером. 25

Концентрации, при которых наблюдают

50 g, ингибирование, связывание конъюгата

Pd (2+)-копропорфирин 1 — пероксидаза со свободным Pd (2+)-копропорфирином 1 и

его производными оказались следующими, 30

M:

1. Pd-копропорфирин — 4,2 10

2. Zn-копропорфирин — 4 10

3. Копропорфирин 1 — 1,3 10

4. Копропорфирин 3 — 2,3 10 .. 35

5. Цикло-Pd-копропорфирин — 9,3 .10

6. Гематопорфирин IX не взаимодействует.

7. Pd-копропорфирин 1 — соевый инги- 40 битор трипсинэ — 2. 10 9.

8.Рб-копропорфирин 1 — бычий сывороточный альбумин — 1,4 10

-9

Как видно из приведенных да,ных, антитела с высоким сродством связываются 45 со свободным Pd (2+)-копропорфирином.

Замена атома Pd (2+) на атом Zn ухудшает связывание на 4 порядка, а с копропорфирином без металла связывание уменьшается более чем в 1000 раз. Моноклональные антитела чувствительны к природе боковых заместителей порфиринового кольца. Они совсем не взаимодействуют с природным гематопорфирином IX, что является их достоинством по сравнению с моноклональными антителэми ЗД, 9G, 2F (прототип), 55 поскольку связываются с этим соединением даже в том случае, если его содержание в исследуемом биологическом образце велико. Моноклональные антитела на 4 порядка хуже взаимодействуют с природным копропорфирином 3, т,е, на порядок хуже, чем моноклональные антитела гибридомы

ЗД, 6Е, 2G. Они на полтора порядка хуже взаимодействуют с цикло-Pd-копропорфирином, чем моноклональные антитела 3Д, 9G, 2F. Таким образом, моноклональные антитела заявляемой гибридомы более специфичны по отношению к копропорфирину 1, чем гибридомы прототипа. Это позволяет уменьшить перекрестные реакции при проведении иммунологических анализов, Пример. Применение Pd-копропорфирина в паре с монАТ 5Д, 9Л, 2F в качестве проявляющего реагента в иммунофосфоресцентном анализе на инсулин.

В методике используют также монАТ к инсулину в твердофаэном конкурентном варианте иммуноаналиэа.

Смесь монАТ к инсулину (6 10 M) с различными концентрациями инсулина (1,75 .10 — 5 10 " М) инкубируют в лунках микропланшета с предварительно адсорбированным инсулином в течение 1 ч при 37 С в ФБРТ. В качестве контроля служит микропланшет, на поверхности которого адсорбирован бычий сывороточный альбумин.

Затем планшеты отмывают ФБРТ и инкубируют в течение 1 ч с кроличьими антимышинымиантителами(6 10 М) и насыщающей

-в концентрацией комплекса моноклональные антитела — Pd (2+)-копропорфирин 1, После отмывания сорбированного на полистироле комплекса проводят его десорбцию и измерение фосфоресценции.

Результаты показывают, что минимальная концентрация инсулина, определяемая в данной схеме, приблизительно равна 5х х10 M.

Минимальная концентрация инсулина, определяемая с помощью иммунопероксидазного ПАП метода, соответствует 1. 10

M при одинаковых условиях проведения анализа, т.е, монАТ 5Д. 9G. 2F позволяют повысить чувствительность определения на пол порядка.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L. ВСКК(п)

М 356Д-и родуцент моноклонал ьн ых антител к Pd-копропорфирину-1.