Способ подготовки культуры клеток к электронно- радиоавтографическому исследованию

 

Изобретение относится к медицине, а именно к радиоавтографическим методам исследования. Целью является более полное выявление ДНК в клетке. Цель достигается тем, что клетки из кожи культивируются со средой MEM с 10%-ной телячьей сывороткой при 37°С в течение 5 дней. Далее к культуре добавляют меченый тимидин в концентрации 10 мкКи/мл. Через 2 ч культуру фиксируют, обезвоживают и заключают в эпоксидные смолы. Готовый эпоксидный диск вынимают из чашки и на нижнюю его поверхность наносят фотоэмульсионный слой, который фиксируют и проявляют в растворе гипосульфита и парафенилендиамина. Диски просматривают под микроскопом , места скопления метки вырезают для электронно-микроскопического исследования . Способ позволяет оценить культуру клеток, ее жизнеспособность, пригодность к пересадке.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 6 01 N 1/28

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

< Н ",, ";

1,1р .„.

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4264974/14 (22) 17.06.87 (46) 07.09.91. Бюл. N 33 (71) Институт хирургии им. А. В. Вишневского (72) А.А.Пальцын, В,П.Туманов и Г.Г.Серов (53) 616-0.89.9(088.8) (56) Pat et ai., Science. 1982, 217, 4565, 1155—

1156. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КУЛЬТУРЫ

КЛЕТОК К ЭЛЕКТРОННО-РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к радиоавтографическим методам исследования. Целью является более полное выявление ДНК в клетке. Цель достигаИзобретение относится к медицине, а именно к методам радиоавтографического исследования.

Целью изобретения является более полное выявление особенностей синтеза ДНК в клетках культуры.

Способ осуществляют следующим образом.

Часть взятого дерматомом лоскута кожи помещают в 0,25%-ный раствор трипсина.

Далее из него получают взвесь клеток, которая высеяна в чашки с начальной плотностью 10 клеток/см в среде МЕМ с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Клет- . ки инкубируют при 37ОС, в выбранный для исследования момент инкубации в среду вводят тимидин — Н и через 2 ч культуру фикз сируют. Тимидин вводят в концентрации 10

„„!Ж„„1675727 А1 ется тем, что клетки из кожи культивируются со средой МЕМ с 10%-ной телячьей сывороткой при 37 С в течение 5 дней. Далее к культуре добавляют меченый тимидин в концентрации 10 мкКи/мл. Через 2 ч культуру фиксируют, обезвоживают и заключают в эпоксидные смолы. Готовый эпоксидный диск вынимают из чашки и на нижнюю его поверхность наносят фотоэмульсионный слой, который фиксируют и проявляют в растворе гипосульфита и парафенилендиамина. Диски просмйтривают под микроскопом, места скопления метки вырезают для электронно-микроскопического исследования. Способ позволяет оценить культуру клеток, ее жизнеспособность, пригодность к пересадке. мкКи/мл. Фиксацию проводят при 2-4 С

2,5 -ным раствором глутарового альдегида и 1%-ным раствором четырехокиси осмия.

Затем культуру обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации и непосредственно в чашках заливают эпоксидной смолой. В таком виде клетки полимеризуются до получения твердого блока. Пластмассовый диск из чашки удаляется и на поверхность, обращенную к дну чашки, наносят фотозмульсионный слой (типа M). Экспозицию диска с фотоэмульсионным слоем проводят в темноте при комнатной температуре в течение 3 сут. Проявителем Д вЂ” 19 проявляloT и затем фиксируют фотоэмульсионный слой в 20%-ном растворе гипосульфита.

Диски просматривают в микроскопе, подсчитывают содержание меченых клеток.

1675727

Формула изобретения

Способ подготовки культуры клеток к электронно-радиоавтографическому исследованию. включающий инкубацию клеток с тимидиновой меткой, их фиксацию. заключение в эпон, приготовление срезов, нанесение фотоэмульсионного слоя, его экспозицию и проявление, о т л и ч а ющ и и с. я тем, что, с целью полного выявления ДНК, фотоэмульсионный слой наносят после заключения клеток в эпон непосредственно на нижнюю поверхность слоя клеток, а экспозицию и проявление проводят перед приготовлением срезов, при этом в качестве проявителя применяют водный раствор парафенилендиамина, 35

Составитель Л,Стебаева

Техред M.Моргентал Корректор M.Mýêcèìèøèíåö

F åäàêòîð Л.Волкова

Заказ 2996 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "I la re ;> ", r. Ужгород, ул, Гагарина, 101

Меченые области вырезают для дальнейше-. го электронно-радиоавтографического исследования. Предлагаемый способ основан на использовании эпоксидного диска в качестве радиоавтографического препарата, flo такому препарату можно составить заключение о распределении метки с любыми увеличениями светового микроскопа и безошибочно выбрать участок для электроннорадиоавтографического исследования.

Важным преимуществом предлагаемого способа сравнительно с ранее известным является нанесение фотослоя на нижнюю поверхность культуры со стороны базальных клеток, В предлагаемом способе между базальными клетками и фотослоем нет преграды в виде верхнего ряда ороговевших клеток.

Пример 1. Участок кожи помещают в

0,257 >-ный раствор трипсина, выделяют взвесь клеток, засевак>т в чашки из оргсгекла с начальной плотностью 10 клеток/см

4 2 со средой MEM с 10 ф,-ной эмбриональной телячьей с>>вороткой, На пятый день инкубации в среду вводят тимидин-Н и через з

2 ч культуру фиксируют и заключают в

ЭПОН. При анализе эпоксидного диска в световом микроскопе обнаружено 1,5% синтезирующих ДНК базальных клеток, Меченые клетки во всех случаях располагаются на периферии колонии, что позволяет аким образом выявить зону роста колоний, Центры колоний были покрыты ороговевшими клетками. Следовательно, проведенное предлагаемым способом исследование эпоксидного блока показало топографию роста и созревания эпидермоцитов: размножение на периферии колонии с нарастающей дифференцировкой клеток, расположенных ближе к центру, и вытеснение накопивших роговое вещество клеток вверх.

После анализа диска в световом микроскопе пять синтезирук>щих ДНК клеток были отмечены на поверхности диска и в отмеченных участках вырезаны образцы для приготовления электронно-микроско5

1 5>

30 пических срезов. Г1оследние залиты эмульсией "М", экспонированы в течение 7 дней и проявлены, как описано выше. Просмотр электронно-радиоавтографических препаратов показал, что во всех 5 случаях мечеными, т. е, синтезирующими ДНК, оказалиСь базальные эпидермоциты, о чем свидетельствуют многочисленные десмосомы и тонофибриллы, Расположенные рядом немеченые эпидермоциты имели более выраженные признаки дифференцировки — накопление гранул кератогиалина, сильнее развитую и более грубую тонофибриллярную сеть.

Таким образом, исследование предлагаемым способом конкретной культуры клеток, выделенных из кожи человека, не только дает сведения об особенностях развития культуры, но и позволяет оценить пригодность клеток кожи для пересадки обожженным. Исследование показало, что культура состоит из эпидермоцитов и не содержит посторонних "загрязня>ощих" клеток, например фибробластов. Культура содержит достаточное количество живых, размножающихся клеток, следовательно, пригодна как к пересадке и приживлению на больных, так и к дальнейшему культивированию с целью увеличения объема пересаживаемого материала.