Способ определения количества меченых клеток

 

Изобретение относится к области иммунохимии и иммунологии и к исследованиям биологического материала путем азтсм8- тического анализа его взаимодействия с флуоресцентной меткой и может быть использовано в иммунологии и иммунохимии при проведении научных исследований. Целью изобретения является упрощение и повышение точности определения количества меченых клеток относительно их общего количества. Способ включает инкубацию пробы с флуоресцирующим индикаторным материалом, облучение возбуждающим светом регистрацию флуоресцентной эмиссии с помощью сканирующего микрофлуориметра. В качестве флуоресцирующего индикаторного материала используют флуоресцентный латекс, а пробу дополнительно флуорохромируют. Затем проводят облучение возбуждающим светом з диапазоне длин волн от 360 до 480 нм с регистрацией флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин вели от 400 дл 550 нм и от 430 до 600;нм с регистрацией флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн от 530 до 700 нм, затем полученные результаты сравнивают между собой и по результатам сравнения судят о количестве меченых клеток , связавшихся с флуоресцирующим индикаторным материалом, относительно общего числа клеток з пробе. Анализ прово- .дят гомогенно, без разделения связавшегося и не связавшегося с биологическими частицами индикаторного материала. Способ прост в исполнении и позволяет помимо абсолютного количества связавших индикаторные частицы клеток, определять их относительное количество в пробе. 4 ил. О XI sj ю

СОЮЗ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5I) и 6 01 N 33/5:. 3

ГОСУДАРСТ8Е ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

01 ЙФ.

6 (21) 4644254/14 (22) 26.12.88 (46) 07.09,91. Бюл. М 33 (71) Всесоюзный научно-исследозатзл кий институт биологического приборостроения и Институт иммунологии (72) Е.И.Овчарова, АГ.Сухомудренко и С.Б.Ульянченко (53) 615.475(088.8) (56) Патент США (Ф 3902971, 1965. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МЕЧЕНЫХ КЛЕТОК (57) Изобретение относится к области иммунохимии и иммунологии и к исследованиям биологического материала путем автоматического анализа его взаимодействия с флуоресцентной меткой и может быть использовано в иммунологии и иммунохимии при проведении научных исследований.

Целью изобретения является упрощение и повышение точности определения количества меченых клеток относительно их общего количества, Способ включает инкубацию пробы с флуоресцирующим индикаторным

Изобретение относится к иммунохимии и иммунологии, в частности к способам автоматизированного анализа взаимодействия биологических клеток с индикаторными частицами, мечеными флуорохромом.

Целью изобретения является упрощение и повышение точности определения количества меченых клеток относительно их общего количества.

„., Ы„„1675772 А1 материэлом, облучение возбуждающим светом И регистрацию флуоресцентной эмиссии с помощью сканирующего микрофлуориметра. В качестве флуоресцирующего индикаторного материала используют флуоресцентный латекс. à пробу дополнительно флуорохромируют. Затем проводят облучение возбуждающим светом в диапазоне длин волн от 360 до 480 нм с регистрациеи флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн от 400 дл 550 нм и от

430 до 600 чм с регистрацией флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн от 530 до 700 нм, затем полученные результаты сравнивают между собой и по результатам сравнения судя1 о количестве меченых клеток, связавшихся с флуоресцирующим индикаторным материалом, относительно общего числа клеток s пробе, Анализ прово. дят гомогенно, беэ разделения связавшегося и не связавшегося с биологическими частицами индикаторного материала. Способ прост в исполнении и позволяет помимо абсолютного количества связавших индикаторные частицы клеток, определять их относительное количество в пробе, 4 ил, На фиг.1 изображена гистрограмма распределения по амплитуде сигналов от розеток тимоцитов мыши с флуоресцентными латексными частицами, мечеными пиронином Х при длине волны возбуждающего света 430-600 нм с регистрацией флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн от

530 до 700 нм; на фиг.2 — гистограмма распределения по амплитуде сигналов от всех (как меченых, так и немеченых) биологиче1 6 - 772 ских клеток. Длина волны возбуждающего света 360-480 нс„регис.гр" ция флуоресцек тнай эмиссии 400-550 нм; на фиг.3 — гисто1рамма распределения сигналов по амплитуде при окраске тимоцитав флуаресцирующими .:» антителами по известкому спосо6у (ваэбух,дение 360 — 480 нс и регист„-ация 400--550 -I;:.:.. нд фиг,4 - гистограмма расг реде," ения Р",гна" лов от сенсибилизированных латексных час. тиц до внесения тимоцитов, Гистрограмма распределения сигналов от розеток сенсибилиэи авакных латек. -;,— ных частиц с тимоцита)-;и, несущими :пу 1,, антиген при облучэнил их светом с длина. ., волны 430 — 600 км (преиму цественка !=:,03 нм) и регистрацией флуаресцектной эмиссии в диапазоне длин волH 530 — 700i км (пр:;-... имущественно 560 нм1 приведена на фиг. 1, Количество импульсов в пике r IOTci раммы (23 импульса) сорта:=.тствует каличе- - 0 ству латексных розеток в анализируемом препарате, При визуальном наблюдении видны ярко-красные латексные розет(и,. Затем сканирующий =тол во"- вращали в исходное положение и сканировали тот ?ке "-препарат при возб)ух<дени л светам с длиной волны 360 — 480 нм (преимущественно 450» нм). Флуаресцектну)а змисслю регистрировали в диапазоне длин волк ат 400 до 550 нм (преимущественна 580 нм), При а ray;Iä);- 30 кам наблюдении видна ярко-зеленa.- флуаресценция тела тимс)цитов.

Количество импульсов в г) ике гистог раммь) (фиг,2, 25 импульсов ) сао,-ветствует общему количесту тимоцитов 8 анализируемой iIpoGB. 35

По результатам сканирова",ия вычисляflI! ОТНОШЕКИ8 KO)I_#_!IecTBB TИМОЦИТОВ, Нес>щих thy 1,1 антиген, к общему количеству

О тимоцитов в пробе: -, = 100 (, =- 92;4.

25 40

При выполнении анализа известным способом в качестве индикаторных частиц использовали монокланальные антитела„ меченые флуаресцен эотиаци анатом (ФИТЦ).

Гистограмма сигналов„палучаемы? г ри сканировании тимоцитав, обработанных специфическими антитвлами, меченьи и

ФИТЦ, представлена на ()иг.3.

Пример 1. Примерам пробы, содеа- 60 жащей биологически —: )(летки, Является cyc— пензия тимоцитов мыши в забуферном физиологическом растворе рй 7,4.

Индикаторные частицы, меченые фл орахромам, получали нагр8ванием 1,5; р- -Ii )" !55 го раствора меламина в Зф-,-кам растворе . формальдегида C äoáaâëeíèeì 10 — i6:.) М) флуоресцентного красителя пираника,)К

Нагревание проводи. и ка кипящей водяной бане до помутнения.

Полученку)о, таким образом, суспенэи ю манодисперс н ых флуаресцирующих латекскь)х частиц отмывали декантацией и сенсибилиэировали моноклональными антителами K ti»y !„1 антигену путем каваленг" нoI г? nIэисоедикения их с пОмощью глутаравага альдегида.

Генсибилизированные флуоресцирующие индикатарны8 частицы добавляли в

Гробу. Содержащую тимоциты мыши линии Я»Д в коне)ектраоии ) „: 10 кл/мл из расчета 300 индикаторных "-:а;тиц на 1 тимацит.

Тимациты ин к1 би ровали в течение 1 ч, ГКЭСЛЕ ЧЕГО ПРОВОДИЛ, !O»I5pa6OTKV Il!Х ГЛутара --:i=. м альд8гидам, ДобавляЯ ега к праб8 Да

-;анечкой какцентрац;.;и 0,2 У„-.

Г рабу инкубиравали с глутаровым альдегидом з -,ечение ", ч. после чего каплю

".успенэии накосили на предметное ст8клО, накрывали покравным стеклам и края стеклa парафинировали.

Палученнь:й таким образом препарат анализировали с помощью микрофлуориме» ра Ор(ап со сканирующим столом. Обработку сигналов проводили с помощью комп ьюте ра й/аг g-720, Па, а.-,;"III сканирования при проведени,:. анализа извесгным способ)ам, можно установить абсолютное количество меченых тимоцитов 8 npubc 23), но нельзя определить их oTHGcl Tenьнае каличествО (см. таб лицу I).

Иэ гистограммы (фиг,4) видно, что сигналы ат несвязавши:,ся латексных частиц легко or;",I!ôôepeHöèpoBBTI ат сигналов ла;екскы>: роaåòoê па амплитуде (NI). Поэтому акалиэ па предлагаемому способу г)равадлтся гомогенно, беэ удаления Henpopear! Iровавших индикаторных частиц, меченых флуорахромам, чта снижает -:рудоемкость проведения анализа в сравнении с известным способом, в катаром несвязавшиеся фл; ооесц,р (IOLi,He - дикатарные час гицы неабходлма удалить фильтрацией либо мнаг )KpaTI-,,IM центрифуги poBBH IBM, П „- и м е- р 2. i» ка -,естве -OI!IMepa пробы, сздержащей биолог),веские клетки, использовалась суспензия перитональных макрс )агав мы»IA линии С 3А s cpe+8 199 с :О/-нсй инактивированной сыворотки .рупно:-.В рагатогс ск:::та.

Индикатарнь;е частицы получали как

Описана в примере ц но Не подвергали сен сибилиэации антителами.

2 мл cycneHэии макрафагав с концентрацией 1 х ",О кл/мл,аслаивали на поверхность пластиковой чашки Петри диаметром

40 мм и инкубировали в течение 1 ч. Затем

:аи.ку ополаскивали средой 199, наслаивали ка паверхнОсть о .)разoBGBIi)егоñÿ на 88

1675772

ФЧ вЂ” .„ 00$ = 75-",ь. возбуждения и регист а ии самих клеток омаметчика е может быть выполнено щее количество тиоцитов в пробе (25) дне монослоя макрофагов 2 мл среды 199 с

10 сыворотки крупного рогатого скота и вносили индикаторные латексные частицы из рас, етв 200 частиц на 1 макрофаг.

Ь ькрофаги инкубировали с латексом с течение 2 ч, затем ополаскивали чашки Петри эабуференным физиологическим раствором„высушивали и сканировали с помощью микрофлуориметра 0pton с обработкой сигналов на компьютере УУапц-720.

По результатам сканирования при возбуждении 430-600 нм и регистрировали флуоресцентной эмиссии при 530-700 нм судили об абсолютном количестве макрофагов, поглотивших латексные частицы (50 шт).

По результатам сканирования при возбуждении 360 — 480 нм и регистрации флуоресцентной эмиссии при 400-550 нм судили об общем количестве макрофагов в пробе (67 шт,), По полученнымданчым определяли отношение макрофагов, поглотивших индикаторные частицы к общему количеству макрофагов в пробе — фагоцитарное число (ФЧ):

Фагоцитарное число является показателем функциональной активности макрофагов и может измениться, в частности. под воздействием иммуномсдулирук>щих веществ.

Пример 3, Анализ выполняется аналогично списанному в примере 1, но при получении индикаторных частиц в исходную латексную рецептуру вносят взамен пиронина Ж 100 — 160 мг родамина 6 Ж.

Предлагаемый способ значительно упрощает в сравнении с известным определение в пробе количества биологических клеток, связывающих флуоресцирующие индикатооные частицы. поскольку исключает необходимость удаления несвязавшихся индикаторных частиц.

Предлагаемый способ в отличие от изб.:. ного позволяс г помимо абсолютного

5 количества связавших индикаторные частицы леток определять их относительное количество в пробе, что имеет важное значение, поскольку для оценки функциона-ьного состояния клеток к иммунологии

10 используются, именно, относительные показатели, позволяющие сопоставлять дан --ые опытов, полученных на пробах, содержащих различное количество клеток рробы от разли ных. больных, различных

15 лабораторных животных, анализ динамики

;.эманечия количества клеток, экспрессируюших изучаемый рецептор под влиянием разя . ных иммуномодуляторов и т,п,).

Формула изобретения

20 Способ определения количества меченых клеток путем инкубации клеток с индика.орными частицами, мечеными флуорохромом, с последующим нанесением на подложку и подсчетом флуоресцентно

25 меченых клеток при помощи сканирующего микрофлуориметра, отличающийся тем, чтс, с целью упрощения и повышения точ;--ости определения количества меченых клеток огносительно их общего количества, 30 в качестве:;:íäèêатарных частиц использук:т частицы монодисперсного латекса, окрашенные иренином Ж, или родамином 6Ж, ". после инкубации клеток с индикаторными частица::,и их обрабатывают глутаровым

35 альдегидом с последующим подсчетом меченых клеток при возбуждении светом с длиной волны 430 — 600 нм и регистрации

Флуоресцентной эмиссии в диапазоне длин волн 530 — 700 нм, и подсчетом общего коли40 чества клеток при возбуждении светом с длиной волны 360 — 480 и регистрации флуорес BHTHQA эмиссии в диапазоне длин волн

400-550 нм, и вычислением относительного количества меченых клеток, ьтагы анализа при сканировании в дипазоне длин волн, оптимальном для: ительное количество тимоцитов, несуh» 1,1 антиген; 23:25 х100 = 92

1675772

< г 5Ю18У1Р

Составитель П. Бонарцев

Техред M.Моргентал Корректор О. Кундрик

Редактор М, Бланар

Производственно-издателнский комоинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2998 Тираж 388 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям. при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5