Способ диагностики вирусных заболеваний пасленовых культур

 

Изобретение относится к иммуноферментам методом диагностики и может быть использовано в селекционной и семеноводческой работе при оценке зараженности растительного материала фитопатогенными вирусами. Целью изобретения является повышение специфичности способа. Способ заключается в том, что специфичные к тестируемому вирусу антитела сорбируют на твердой фазе, их избыток отмывают буфером промывания (БП), содержащим (мас.%) трис (гидроксилметил)-аминометан 0.007- 0,011; глицин 0,070-0,068; хлористый натрий 1,753-3,800; твин-20- 0,050-0,100; дистиллированную воду, проводят блокировку твердой фазы пробно-коньюгатным буферным раствором, содержащим (мас.%) трис (гидроксиметил)-аминометан 0,550- 0,605; глицин 0,409-0,375, твин-20- 0.50- 0,100; обезжиренное молоко 5,000-30,000, мертиолат натрия 0,001-0,006; дистиллированную воду остальное, наносят последовательно сок исследуемых растений и коньюгат, разведенные в пробно-коньюгатном буферном растворе, инкубируют, отмывают несвязавшиеся компоненты БП. вносят раствор субстрата, инкубируют и измеряют величину оптической плотности при длине волны 490 нм и при значении плотности 0,2 и выше диагностируют наличие вируса в соке. 2 ил. fe

СС!!ОЗ !.OBf Т!.XÈÕ

СOI (ИЛ !И! И fF СТИХ

Р Е C l1Yh 1l1K

ГОСУДАРСТВЕН1!ЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4695024/13 (22) 18,05.89 (46) 15.01.92. Бюл. М 2 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений (72) В.С.Обручков (53) 632.3 (088.8) (56) Сборник научных трудов НИИ картофельного хозяйства "Селекция и семеноводство картофеля". 1985, 81-86. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАСЛЕНОВЫХ КУЛЬТУР (57) Изобретение относится к иммуноферментам методом диагностики и может быть использовано в селекционной и семеноводческой работе при оценке зараженности растительного материала фитопатогенными вирусами. Целью изобретения является повышение специфичности способа. Способ заключается в том, что специфичные к тестируемому вирусу антитела сорбируют на

Изобретение относится к иммуноферментным методам диагностики и может быть использовано в селекционной и семеноводческой работе при оценке зараженности растительного материала фитопатогенными вирусами.

Целью изобретения является повышение специфичности способа.

На фиг, 1 и 2 представлено распределение величин оптических плотностей, полученных предложенным и известным способам здоровых и больных образцов растений.

Способ диагностики вирусных заболеваний пасленовых культур заключается в том, что специфические к тестируемому ви„., SU ÄÄ 1705344 А1 о!ls С 12 N 7/00, G 01 N 33/53 твердой фазе. их избыток отмывают буфером промывания (БП), содержащим (мас. $) трис (гидроксилметил)-аминометан 0,0070,011; глицин 0,070 — 0,068; хлористый натрий 1,753-3,800; твин-20- 0,050-0,100; дистиллированную воду. проводят блокировку твердой фазы пробно-коньюгатным буферным раствором. содержащим (мас. $) трис (гидроксиметил)-аминометан 0,5500,605; глицин 0,409 — 0.375, твин-20- 0,500,100; обезжиренное молоко 5,000-30,000, мертиолат натрия 0,001 — 0,006; дистиллированную воду остальное. наносят последовательно сок исследуемых растений и коньюгат, разведенные в пробно-коньюгатном буферном растворе, инкубируют, отмывают несвяэввшиесв компоненты БП, вносят раствор субстрата, инкубируют и измеряют величину оптической плотности при длине волны 490 нм и при значении плотности 0,2 и выше диагностируют наличие вируса в соке. 2 ил. русу антитела сорбируют на твердой фазе (в лунках полистиролового планшета), их избыток отмывают буфером промывания (БП), имеющим следующий состав, мас.7,:

Трис (гидроксиметил)-аминометан 0,007 — 0,011

Глицин 0,070 — 0,068

Хлористый натрий 1,753-3,800

Твин-20 0,050-0. 100

Дистиллированная вода Остальное

Проводят блокировку твердой фазы пробноконьюгатным буферным раствором (ПКБ) со следующим составом компонентов, мас. 7ь:

1705344

0,007

0,070

1,753

0 050

Трис (гидроксиметил)-амин ометан 0,550-0, 605

Глицин 0,375 — 0,409

Твин-20 0,050- 0,100

Обезжиренное молоко 5. 000-30,000

Мертиолат натрия 0,001-0,006

Дистиллированная вода Остальное

Наносят сок исследуемых растений. разведенный в пробноконьюгатном буферном растворе (ПКБ), и коньюгат (антитела, меченные пероксидаэой), разведенный в

ПКБ; инкубируют и отмывают несвязавшиеся компоненты БП; вносят раствор субстрата, содержащего о-фенилендиамин, концентрированную перекись водорода, инкубируют в темноте на протяжении 30 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации реакцию останавливают добавлением в раствор субстрата 1N соляной кислоты.

Затем измеряют величину оптической плотности реакционной смеси на микрофотометре при длине волны 490 нм.

При значении оптической плотности 0,2 и выше диагностируют наличие вируса в исследуемой пробе сока растений, Способ позволяет повысить специфичность ИФА при сохранении его высокой чувствительности, Исследованы одни и те же образцы сока клубней картофеля предложенным и известным способами ИФА.

На фиг. 1 и 2 графики полученных результатов, Способ обл адает бол ьшей специфичностью по сравнению с известным. так как уровень фоновых реакций на фиг. 1 не превышает 0,2 ОП, B то время как на фиг. 2 уровень фоновых реакций достигает 1,0 ОП. и выше, что говорит о неспецифичности известного способа.

Пример 1. Берут два клубнеплода картофеля сорта Арика, один из которых заражен У-вирусом, а другой здоровый. Из каждого клубня выделяют сок в две пробирки и проводят анализ.

Для этого антитела, специфичные к Yвирусу, предварительно разведенные в натрий-карбонатном буфере, рН = 9,6, раскапывают в лунки планшета (no 0,1 мл в лунку) и инкубируют в течение 2 ч при 37 С, По окончании сорбции AT на твердой фазе содержимое планшета вытряхивают, высушивая его на фильтровальной бумаге, и трижды отмывают буфером промывания (БП), содержащим следующий состав компонентов, мас. 7;:

Трис (гидроксиметил)-ами10

55 нометан

Глицин

Хлористый натрий

Твин-20

Дистиллированная вода Остальное

С учетом последующего разведения тестируемых проб в лунки планшета раскапывают пробно-коньюгатный буфер (ПКБ) (no

0.090 мл в лунку), содержащий следующий состав компонентов, мас. ф,:

Трис (гидроксиметил)-аминометан 0,550

Глицин 0,409

Мертиолат 0.001

Обезжиренное

МОЛОКО 5,000

Твин-20 0,050

Дистиллированная вода Остальное

После блокировки в лунки планшета вносят тестируемые пробы 0,010 мл в лунку, пеоемешивают их с ПКБ и инкубируют в течение 16 ч при 6 С. По окончании процедуры содержимое планшета вытряхивают и отмывают три раза БП. высушивая его после каждой промывки на фильтровальной бумаге.

Коньюгат (антитела, меченные пероксидазой) разводят в рабочем объеме ПКБ, раскапывают в лунки планшета (no 0,090 мл в лунку) и инкубируют в течение 2 ч при 37 С.

По окончании процедуры еодержимое планшета вытряхивают и отмывают пять раз БП, высушивая его прсле каждой промывки на фильтровальной бумаге, Готовят раствор субстрата в рабочем объеме 0,1 М фосфатно-цитратного буфера рН = 5,0, в который вносят 4 мг о-фенилендиамина и 0,005 мл концентрированной перекиси водорода. После растворения субстрат раскапывают в лунки планшета (по

0,090 мл в лунку) и инкубируют в темноте на протяжении 30 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации реакцию останавливают добавлением в раствор субстрата 1 N соляной кислоты (по 0,060 мл в лунку).

Измеряют величину оптической плотности на микрофотометре при длине волны

490 нм.

Значения ОП, полученные в этом примере для здоровых и зараженных образцов, соответственно составили 0,009 0,003 и

0,168 «+0,037 ОП..Из сопоставления этих данных можно заключить, что предложенный способ обладает достаточно высокой специфичностью, так как положительные и отрицательные результаты достоверно от1705344 личаются друг от друга. В то время как при использовании известного способа величины оптических плотностей для здоровых и зараженных образцов соответственно составили 0,239 + 0,074 и 0,408 +. 0,281 ОП.

Снижение содержания компонентов в буферных растворах ниже указанных границ приводит к ухудшению качества отмывки планшет и увеличивает вероятность возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в методе

И ФА.

Пример 2. Методика проведения И ФА та же, что и в примере 1, но используют другие соотношения компонентов в рекомендуемых буферных системах.

Так, разведение растительного сока и коньюгата проводят в ПКБ, имеющем следующий состав компонентов, мас.%;

Трис (гидроксиметил)-аминометан 0,605

Глицин 0,375

Метриолат 0,006

Обезжиренное молоко 30,000

Твин-20 0.100

Дистиллированная вода Остальное

Отмывку планшета от несвяэавшихся компонентов проводят БП, содержащим следующий состав, мас. ;

Трис (гидроксиметил)-аминометан 0,011

Глицин 0,068

Хлористый натрий 3,800

Твин-20 0,100

Значения ОП, полученные в этом примере для здоровых и зараженных образцов, соответственно составляют 0,119 ч- 0,018 и

0,305 ++.0,034 ОП. Из полученных данных следует, что уровень фоновых реакций не превышает величины 0,20 ОП. (см. фиг. 1 и

2).

Дальнейшее увеличение содержания компонентов в этих буферных системах нецелесообразно, так как снижается специфичность способа, приводит к повышению расхода реактивов.

Пример 3. Методика проведения теста та же, что и в примере 1 (с учетом внесенных изменений), но используют другие соотношения компонентов, Состав ПКБ. оптимизированный по средним значениям, мас,,:

Трис (гидроксиметил)-аминометан 0,555

Глюцин 0,400

Мертиолат 0,002

Обезжиренное молоко 10,000

0 050

Твин-20

Дистиллированная вода Остальное

Состав БП, оптимизированный по сред5 ним значениям, мас.ф,:

Трис (гидроксиметил)-аминометан 0,008

Глицин 0,069

Хлористый натрий 2,9225

10 Дистиллированная вода Остальное

Интенсивность положительных реакций в этом случае составила 0,216 .0,027 ОП при средней величине фона 0,038 0.002

15 ОП. Сопоставив средние величины ОП в ПК и ОК, видим, что они отличаются друг от друга в большей степени, чем в предыдущем примере. Однако эта разница оказалась меньшей, чем в примере 1.

20 Пример 4, Методика проведения теста та же, что и в примере 1, но в качестве ОК был протестирован образец здорового клубня (масса 3 гр) С. Гатчинский, а в качестве

ПК-образец клубня того же сорта и массы, 25 зараженного Х вирусом картофеля (XBK).

Средний уровень фона в примере 4 не превышал 0,020 ч 0,006 ОП. а интенсивность положительных реакций достигала

0,611 ч: 0 020 ОП

30 В то время, как у прототипа эти величины соответственно составили 0,257 + 0,163 и 0,902 + 0,216 ОП. Очевидно, что способ превосходит прототип по специфичности тестирования здоровых образцов при со35 хранении достаточно высокого уровня положительных реакций.

Пример 5. Методика проведения теста та же, что и в примере 2. При этом тестировали те же образцы клубней картофеля, ко40 торые были проведены в примере 4.

Средний уровень фоновых реакций в этом примере также повысился, как и в примере 2, и составил 0,104 0.030 ОП. Интенсивность положительных реакций достигла

45 величины 0,821 " 0,094 ОП и оказалась выше, чем в предыдущем примере.

Пример 6, Методика проведения теста та же, что и в примере 3. При этом тестировали те же образцы клубней картофеля, ко50 торые были использованы в примере 4.

Интенсивность положительных реакций незначительно понизилась по сравнению с предыдущим примером и составила

0,739«+0,081 ОП. В то время как уровень

55 фоновых реакций не выходил за пределы средней величины 0,027+0,006 ОП.

Пример 7. Методика проведения теста та же, что и в примере 7, но в качестве ОК был протестирован образец здорового сп.i 7О5314

-0,1 0,0 0, 03 OP DS

Фиг.1

Ф/

70

-0J D,0 0,1 0,2 ОЮ О,Ф О,Х 0,б 0,7 Риг. 2

Составитель В.Обручков

Редактор В.Трубченко Техред M.Moðãåíòàë Корректор M.Êó÷åðÿâàÿ

Заказ 170 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Проиэводс1венно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101

noro плода томатов (масса 3 г) с, Ракета. а в качес|ве ПК Образец плода томатов того же сорта и массы. зараженного вирусом табачной мозаики (ВТМ).

Поскольку интенсивность прохождения 5 положительных реакций у способа и прототипа была оценена одинаково высоко для образца, зараженного ВТМ, т.е, выше 2,00

ОП (микрофотометр зашкаливал), остановимся только на анализе фоновых величин. 10

B примере 7 уровень фона не превышал

0,018 + 0.016 ОП. В то время, как у прототипа фоновые реакции оказались значительно выше и достигали величины 0,179+ - 0,038 ОП, Таким образом, предложенный 15 способ превосходит известный по специфичности тестирования здоровых образцов и в то же время не уступает ему по чувствительности определения ВТМ, XBK и УВК в зараженных плодах томата и клубнях карта- 20 феля.

Формула изобретения

Способ диагностики вирусных заболеваний пасленовых культур с помощью твер- 25 дофазного иммуноферментного анализа, предусматривающий нанесение специфических антител на твердую фазу, отмывку несвязавшихся компонентов с твердой фазой буферным раствором, нанесение иссле- 30 дуемого сока, инкубирование полученной смеси, отмывку несвязавшихся компонентов, нанесение коньюгата, повторное инкубирование смеси, отмывку несвязавшихся компонентов с последующим нанесением субстрата, инкубированием смеси, измерением оптической плотности и оценкой результатов по величине оптической плотности, отл ича ю щи йс я тем, что,с целью повышения специфичности способа, перед нанесением исследуемого сока проводят обработку твердой фазы буферным раствором, содержащим, мас.7(,:

Трис (гидроксиметил}-аминометан 0,550-0,605

Глицин 0,375-0,409

Мертиолат 0,001 — 0.006

Обезжиренное молоко 5,000-30,000

Твин-20 0.050 — 0,100

Дистиллированная вода Остальное, а отмывку несвязавшихся компонентов на всех стадиях анализа осуществляют буферным раствором. содержащим, мас. :

Трис (гидроксиметил)-аминометан 0,007 — 0,011

Глицин 0.068 — 0.070

Хлористый натрий 1.753-3,800

Твин-20 0.050-0, 100

Дистиллированная вода Остальное