Способ регенерации растений из пыльников вишне-черешневых гибридов

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использова^! но в селекционно-генетических работах с плодовыми культурами для получения гаплоидных расте>&шй. Целью изобретения является повымение выхода растений—регенерантов за счет индутсции морфогенеза каллуса. Поставленйая цель достигается тем, что пыльники эксплантируют на питательную среду Хеллера, содержащую дополнительно, мг/л: гидролизат казеина 500-800; дрожжевой экстракт 100—200^ 2,4/10,8-1,0} имк i,o~'i,5j КУК 1,0-3,о;'НУ К 1,0-1,5 и 6-БАП 0,1-1,0. Получен-^ ный каллус культивируют на питательной среде Мурасиге—Скуга, содержащей дополнительно, мг/л; 0,1f-0,9 кинетин; 4,0^6,0 гибберелловая кислота:, 4,0-6,0 ферулловая кислота ',0,5—1 ,5 6 БАП, ИУК-0,5-1,5 и НУК 0,5-1,5. Культивирование осуществляют до образования корневой системы, после чего каллусную ткань с корнями раздепяют на фрагменты, которые пересаживают для индукции побегообразования на питательную среду Мурасиге—Скуга,' содержащую дополнительно, мг/л: кинетин. f, 0-2, О; 6-БАП 3,0-5,0' аденин 1,0-2,0, гибберелловая кислота 1,О— 2,05 ферулловая кислота О,5-0,7i ИУК 0,2-0,4} НУК 0,2-0,4>&, КМК 0,2- - 0,4 и 2,4 Д 0,1-0,3. Полученные растения—per енеранты пересаживают на питательную среду Мурасиге—Скуга, содержащую дополнительно гибберелловую й;ислоту в количестве 1,0-3,0 мг/л, ИМК 0,3-1,0 мг/л. Культивируют до образования нормально развитых растений. 'Использование способа позволяет повысить выход растений-регенерантов до 80-92% от исходно взятых эксплан- 'тов. 2 табл.(ЛсVJ о00 N5

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИН

Щ)5 А 01 Н 4/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГНМТ СССР (21) 4732755/13 (22) 29.03.89 (46) 30.01.92. Бюл. ((- 4 (71) Центральная генетическая лаборатория им. И.В.Мичурина (72) Н.М.-Х.Нафталиев, О.С.Жуков и О.Я.Олейникова (53) 581.143.6 (088.8) (56) Легейда В.С. и др. Получение и изучение каллусной ткани при культи" вировании пыльников черешни и земляники. — "Цитология и генетика". . т. Х, 1976, I("- 6, с. 492-495. (54) СПОСОБ РЕГЕНЕРИЩИ РАСТЕНИЙ ИЗ

ПЫЛЬНИКОВ ВИИНЕ-ЧЕРЕИНГВЫХ ГИБРИДОВ (57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использова но в селекционно-генетических работах с плбдовыми культурами для получения гаплоидных растений. Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов за счет индукции мовфогенеза каллуса. Поставленная цель достигается тем, что пыльники эксплантируют на питательную среду

Хеллера, содержащую дополнительно, мг/л: гидролизат казеина 500-800, дрожжевой экстракт 100-200; 2,4 Д

0,8-1,0ф ИМК 1,0-1,5ф ИУК 1,0-3,0, Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в се- лекционно-генетических работах с плодовыми культурами для получения гапло-. идных растений.

Известна успешная попытка реге«ерации древесных растений, в частности.„SU 1708211 A 1

НУК 1,0-1, 5 и 6-БАП О, 1-1,0. Получен- ный каллус культивируют на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей дополнительно, мг/л: О, 1 -0,9 кинетин;

4, 0-.6, 0 гибберелловая кислота:, 4, 0-6, 0 ферулловая кислота, О, 5-1, 5

6 БАП, ИУК .0,5-1,5 и НУК 0,5-1,5.

Культивирование осуществляют до образования корневой системы, после чего каллусную ткань с корнями разделяют на фрагменты, которые пересаживают для индукции побегообразования на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую дополнительно, мг/л кинетин 1,0-2,0, 6-БАП 3,0-5,0, аденин

1,0-2,0, гибберелловая кислота 1,02,0, ферулловая кислота 0,5-0,7, ИУК О, 2-0,4, НУК О, 2-0,4; К О, 20,4 и 2,4 Д О, 1-0,3. Полученные растения-регенеранты пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую дополнительно гибберелловую Кислоту в количестве 1,0-3,0 мг/л, ИМК 093-1,0 Mr/ле Культивируют до образования нормально развитых растений. Использование способа позволяет повысить выход растений-регенерантов до 80-92% от исходно взятых эксплан тов. 2 табл. тополя, из пыльников, Однако на плодовых культурах этот способ не дает положительного результат».

Известен способ регенерации растений из пыльников черешни и земляники, включающий получение каллуса из пь(льников на среде Мураспге и (;куга с добавлением НУК вЂ” 2 мг/, пндолилук1708211 сусной кислоты (ИУК) 2 мг/л и кинетиня Ь мг/л. (!г(како образовявиийся каллус характеризовался сравнительно невысокими темпами роста и отсутстви5 ем образонания побегов, ()рганогенез из обрязонаниихся тканей не наблюдали ки на одном из испытанных вариантах ср ед °

Целью изобретения является поньпче10 кие выхода растений-регенерантон за счет индукции морфогенезя кяллуса, П р и и е р. Для испьгганий взят ниине-череиненый гибрид )"- 1/1 B трех вариантах опыта: с минимальной, сред- 1 ней и максимальной концентрациями дополнительно вводимых компонентов (см. табл. t ) .

PbIJIhHHKH высаживают на питательную среду Хеллера, содержащую, мг/л. мякросоли КС1 750, NaN()з 600, Mg S()g 2Hz() 250» ИяН Р0,) ° Н О 25

СяС1 ° ЛН 0 75» микросоли — ZT1S()y И () I; H Ü() g п804 4H () 0,1," (:(IS()4 5) (0 01, 25 -г 01

FeS04 /H<() 55 I; Йя . -)ДТА 745, витамины — В((тиямин) 0»1, В6 (IIHpHfT0KcHH) 0 р I » ) Р (, никотино вяя кислота ) О, 5» мез О-и но зит ()»,5» глутя- 0 миновая кислота 1,0». сахароза 20,0 г/л, а) ар-агар

7,0 г/л.

Дополнительно вводят фитогормокы, указанные н табл.1.

После получения каллусной ткани ее пассируют на агяризонанную питательную среду 11урасиге-Скугя, содержащую, мг/л. NH N() 3 1650; КМ0g 1900

СяС1 2Н 0 440; MgS(>q 7Н 0 З70, )0

КЫ»Р0 1/0, Na ЭДТА 37,8, Ye80 (/H<()

?7,Я; NagNo0q 2Н 0 0,25, СцБ()4 5Н.»0

0,025; Hzh() g 6,2, Ип80g" 4Н 0 22,3, Zn SO4 4H <() 8 6; КХ 0 83, Со С 1< 6H <()

0,025, тиаин 0,-4, мезоинозит 100,0, 45 сахароза 30000, агар-агар 10000.

Дополнительно вводят в среду г итогормоны в количестве, указанном н табл.1.

Культивирование осуществляют при

14-16-часовом г»отопериоде в течение

2-3 мес до образования хороио развитой корневой системы, затем кяллусную ткань с корневой системой разрезают на отдельные кусочки и помещают их на питательную cpeIIy Мурясигe-Скугя

В питательную среду Мурясиге и

Скуга вводят, мг/л: кинетин 1,0-2, 0; 6БАП 3,0-5,0; аденин 1,0-2,0, ГК 1,02, )» Феруллоняя кислота 0,5-0, 7 ИУК

О, 2 — (,4, НуК 0, 2-0,4, ИМК О, 2-0

2,4 Д 0,1-0,3 (см. табл.1).

После образования побегов с листьями, чтобы устранить аномалии в росте корней и стеблей у растений-регенерянтов в питательную среду Иурасиге и Скуга ннодят 1,0-3,0 мг/и ГК и 0,3I,0 мг/л И1К.

Культивирование каллусон и выращивание растений-регенерантов ня питательных средах производят ня свету от люминесцентньгх ламп интенсивностью

3000-3500 при 14-16-часовом.фотопериоде и 25-27 0.

Влияние рязчичных добавок фитогормонов на получение кяллуской ткяни, корней и побегов, а также на устранение аномального развития растений регенерантов показано и табл. 2.

Ня минимальной среде получено

498 посеянных пыпьников»пыпьников с кял ,пусом получено?06 пт. или 41,4Х, на средней среде — 453 посеянных пыпьников, пыльников с каллусом 175 ит. или

38,6/, на максимальной среде—

391 посеянный пыльник, пыльников с каллусом 149 или 38,1/.

На минимальной среде получено

50 каллусньгх тканей, каллусон с корнями 10 ит. или 20/, на средней среде — 38 каллусных тканей, каллусов с корнями 10 шт. или 26,3/, ка максимальной среде — 34 кяллусньгх тканей, каллусов с корнями 8 ит. или 23,5/.

На минимальной среде при 140 исходных тканей получено 25 побегов с листьями или 17,9/, ка средней среде при 160 исходных тканей — 30 побегов или !8 8/ на максимальной среде при 120 исходных тканеи — 21 побег или 17,5;!, I

На минимальной среде при 25 кормалько развитых исходных растениях получено 20 растений или 80/, на средкей среде при 26 исходных растениях — 21 нормально развитое растение или 80,8/, на максимальной среде при 25 исходных растениях — 23 нормально развитых растения-.или 92/.

Таким образом„использование пред лагаемого способа обеспечивает 8092,0/-ный выход нормально развитых растений, Изобретение может найти IIHpoKoe применение н селекционно-генетических

Таблица 1

Концентрация компонентов добавки экзогенных регуляторов роста в питательных средах и количество получаемых растений

Этапы осуществления спо регенерации растений ви череиневого гибрида Р 1 при 14-16-часовом фотоп риоде и 25-27 С

Гидролизат казеина

Дрожжевой экстракт

ИМК

2,4 Д

ИУК

H ук

6 1 АН

1 . Иолуч ение каллус ной ткани из пыльников- на среде Хеллера

500,0

650,0

800,"

100ь0

1,0

0,8

1,0

{<э1

200,0

1,5

1,0

3,0

1 УS

1,0

150,0

1,2

0,9

2,0

1,2

2. Вызывание роста корней у пыльцевых каллусов на среде Мурасиге и {;куга

0,1 0,2

4.,0. 5,0

0,3

6,0

Кинетин

I .Ê

Ферулловая кислота

4,0 5,0

6,0 работах с плодовыми культурами для получения гаплоидных растений.

Способ прост, эффективен и не требует дополнительного оборудования и

5 помещений.

Способ позволяет создавать новые формы винне-череюневых гибридов для работ по селекции винни или непосред- 10 ственно для сельскохозяйственногопроизводства, получать ценные генотиTIb< ускорять селекционный процесс в

23 раза по сравнении с обычными способами селекции.

Формула изобретения

Способ регенерации растений из пыльников виине-черешневых гибридов, включающий эксплантации — пыльников на питательную среду, получение каллусной ткани и последующее ее культи.вирование, о т л и ч а и шийся тем, что,.с целью повьп«ения выхода растений-регенерантов за счет индукции морфогенеза каллуса, получение каллусной ткани осуществляют на питательной среде Хеллера, в которую дополнительно вводят 500-800 мг/л гид30 ролизата казеина, 100-200 мг/л дрожжевого экстракта, (1,8-1 0 мг/л 2,4Д, ИМК в количестве 1,0-7,5 мг/л, ИУК

1,0-3,0 мг/л, НУК 1,0-1,5 мг/л и

6БАП в количестве 0,1-1,0 мг/л, пос ледующее культивирование каллусной ткани до образования корней проводят на питательной среде Мурасиге-Скуга в присутствии 0 1-0,3 мг/л кинетина, 4,0-6,0 мг/л гибберелловой кислоты, 4,0 6,0 мг/л ферулловой кислоты, 0,51,5 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,51,5 мг/л ИУК и.{1,5-"1,5 мг/л НУК, после чего осуществляют разделение каллусной ткани с корнями на отдельные кусочки и пассирование их на питательную среду Мурасиге-Скуга, в которую вводят дополнительно кинетин в количестве 1,0-2,0 мг/л, 6бензиламинопурин в количестве 3,05,(1 мг/л, 1,0-2,0 мг/л аденина, 1,02,0 мг/л гибберелловой кислоты 0,50,7 мг/л ферулловой кислоты, 0,20,4 мг/л ИУК,. 0,2-0,4 мг/л НУК, 0,2-0,4 мг/л ИМК, О, 1-0,3 мг/л 2,4 Д и культивируют до образования побегов с листьями, образовавииеся растениярегенеранты пересаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую дополнительно t 0-3,0 мг/л гибберел ловой кислоты и 0,3-1,0 мг/л ИМК, и культивируют до образовачия нормально развитых растений.

1708211

Продолжение табл. 1

Концентрация компонентов добавки экзогенных регуляторов роста в питательных средах и количество получаемых растений

ИУК

НУК

0,5

0,5

1,0

1,0

1,5

1,5

3, Стимуляция роста побегов с зелеными листьями и почками на среде Мурасиге и Скуга

Кинетин

6 hAI I

Лденин

ГК

Ферулловая кислота

ИУК

НУК

ИИК

2р4-Д

2,0

5,0

2,0

2,0

1 э0

3,0

1,0

1,0 l 5

4,0

1%5

1,5

0,6

0,3

0,3

0,2

0,5

0,2 ь2

0,1

0,7

0,4

0,4

0,4

0,3

4. Устранение аномалий в росте корней и стеблей у растений-регенерантов на среде Иурасиге и Скуга

ГК

I ihK

1,О

2,0

0,5

3,0

1,0

5. Количество получаемых растений-регенерантов

18-22

20-23

2 2-24

T à а а и ц а 7

Влияние модификаций питательных сред на достижение положительного эффекта на каждом этапе процесса получения растений-регенерантов при культивировании пыльников винне-чере(аневого гибрида и в сравнении с прототипом

1. Получение каллусной ткани из пыльников на среде Келлера

Частота каллусообразования

500,0 650,0 800„0 из пыльников

Гидрочизат казвина

Дрожжевой экстракт

hyiiK

2, 4-Я(ИУК

ПУК

6-HA II

1(1(1, 0

1,0

1,(1

1,И

0,1

150,0

1,2

0,9

2,0

1,2

0,5

200, О

1,5

1 Р

3,0

1,5

1 И черешни составила 3,1-20,67 на среде Мурасиге и Скуга, с НУК вЂ” 2 мг/л, ИУК вЂ” 8,5 мг/л, кинетина—

0,6 мг/л

1 7(18 21 1

Таблиц с

Влияние модификаций питательных сред на достижение положительного эффекта на каждом этапе процесса получения растении-регенерантов при культивировании пыльников вишне-черешневого гибрида и в сравнении с прототипом

2. Вызывание роста корней у пыльцевых каллусов на среде Мурасиге и

Скуга

0,1 0,2

4,0 5,0

1,0

1,0

1,0

1,5

4,0

1,5

1 ô 5

4,0

0 5 (1,5

0,5

1,0

3,0

1,0

190

3. Стимуляция роста побегов с зелеными листьями на среде Мурасиге н Скуга (1,5 0,6

0,2 0,3

0,2 0,3

0,2 0,3 (1,1 0,2

0,3 0,5

0,7

0,4

0,4

0,4

0,3

3,0

1,0

4. Устранение аномалий в росте корней и стеблей у растений-регенерантов на среде Еурасиге и

Скуга

П р и м е ч а н и е. За граничными параметрами концентраций экзогенных регуляторов роста дополнительный эффект от их введения снижается на всех этапах осуществления способа в ?-3 раза. (Составитель С.Куваева

Редактор Н.Ивыдкая Техред Л. Олийнык 1<орректор И.йуска

Заказ 372 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственногс омитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, .осква, Ж-35, Раущская наб,, д. 4 /5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Кинетин

ГК

@ерулловяя кислота

6-БАП

ИУК

НУК

Кинетин

6 БАП

Аденин

IK

Фвр улл о в ая кислота

ИУК

НУК

ИМК

2,4-/(ГК

_#_iK

О, 3 В ряде, случаев

6 0 наблюдали образование кор6,0 ней. Цифровые

1,5 данные не при1,5 водятся.

1,5

2,0 Образование по5,0 бегов отсутст2,0 вовало

2,0