Способ определения чистоты препаратов плазматических мембран клеток тканей лабораторных животных при отсутствии выраженной генетической патологии

 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения чистоты мембранных препаратов. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что измеряют активности 5'-нуклеотидазы и фумарат-гидратазы, а при отношении обогащения 5'-нуклеотидазы к обогащению фумаразы по сравнению с первым супернатантом, равному 35 - 40, судят о достаточной чистоте выделенных плазматических мембран. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (t1) (s(ls G 01 и ЗЗ/50

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 Т) 4770437/13

У (22) 09.11,89 (46) 30.01.92. Бюл. й. 4 (71) Институт радиобиологии АН БССР (72) В;А.Войткун, А.В.Житкович, А.А,Милютин, Е.Ф.Конопля и Л.M.Ëoáàíoê (53) 577.15.08 (088.8) (56) Мэдди 3. Биохимическое исследование мембран. М.: Мир, 1979. ч.1.

Schapira G., Dobocr I., Plan I,P., Delain Е.

An improved technique for preparation of Skeletae

muscle Сей Р!аэеа membrane. — Biochlmlca ет

B iophyslca Acta, 1974, ч.345., М 3, р,348-358. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСТОТЫ

ПРЕПАРАТОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ MEMEИзобретение относится к биохимии, в частности к способам определения чистоты мембранных препаратов.

Известнь| способы определения чистоты препаратов плазматических мембран путем измерения активности ряда ферментов.

Известен также способ, который предусматривает использование нескольких ферментов для оценки чистоты плазматических мембран.

Недостатками известных способов являются отсутствие универсального биохи мического маркера для саркоплазматического ретикулума, а также отсутствие интегрального показателя, характеризующего общую загрязненность плазматических мембран другими структурами клетки, т.е. сложность осуществления известного способа заключается в неооходимости измерения большого числа ферментов.

Целью изобретения является упрощение способа.

Способ заключается в том, что измеряют активности 5 -нуклеотидазы и фумаратPAH КЛЕТОК ТКАНЕЙ ЛАБОРАТОРНЫХ

ЖИВОТНЫХ ПРИ ОТСУТСТВИИ ВЫРАЖЕННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения чистоты мембранных препаратов. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том, что измеряют активности 5 -нуклеотидазы и фумарат-гидратазы, а при отношении обогащения 5 -нуклеотидаэы к обогащению фумараэы по сравнению с первым супернатантом, равному 35 — 40, судят о достаточной чистоте выделенных плазматических мембран. 1 з.п, ф-лы, .1 табл., 1 ил, Ф гидратазы (КФ 4.2.1.2), а при отношении обогащения 5 -нуклеотидазы к обогащению фумаразы по сравнению с первым супернатантом, равному и более 35 — 40, судят о достаточной чистоте выделенных плазматических мембран.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуют только два фермента, один из которых характеризует только количество плазматических мембран, а второй — все остальные составляющие клетки (микросомы, цитозоль,митохондрии).

Первым ферментом является 5 -нуклеотидаза, вторым — фумараза (фумарат-гидратаза).

Для количественной характеристики степени очистки плазматических мембран вводят коэффициент

Кф = Н/Ф, где Н вЂ” обогащение фермента плазматических мембран (5 -нуклеотидазы) в мембранной фракции по отношению к первому супернатанту (гомогенату);

1709219

Ф вЂ” обогащение фумарат-гидратазы по отношению к первому супернатанту.

Для сравнения с известными методиками, характеризующими препараты плазматических Måмбран, используют коэффициент

Н

Kcr= С+Г где С вЂ” обогащение фермента, присутствующего только в митохондриях (сукцинатдегидрогенаэа); à — обогащение фермента, присутствующего только в микросомах (гл юкозо-б-фосфатаза).

На чертеже представлен график анализа препаратов плазматических мембран, загрязненных в различной степени, Анализ показывает, что зависимость Кф от Ксг линейна с коэффициентом 9 пропорциональности.

Для определения границы достаточной степени чистоты мембранных препаратов анализировали данные по выделению плаэматических мембран (см.таблицу).

Расчет коэффициента Ксгподаннымлитературы показывает, что препараты плазматических мембран, используемые для биохимических исследований, имеют Кс в области выше 3, что соответствует коэффициенту Кф более 35-40. Таким образом, для . характеристики чистоты фракций плазматических мембран можно использовать измерение активности только двух ферментов (5 -нуклестидазы и фумарат-гидратазы) и считать полученные фракции препаратами плаэматических мембран.

Пример 1. Гомогенат ткани центрифугируют 1500 g 10 мин, отбирают 1 мл полученного супернатанта (1 CH) и продолжают выделение мембран по любой методив ке. Измеряют активность 5 -нуклеотидазы в

1 СН (53,6 нг Р/мг белка/ч) и в препарате выделенных мембран (800 кг Р/мг белка/ч), Обогащение 5 -нуклеотидазы составляет

800:53,6 - 15, Измеряют удельную активность фумарат-гидратазы в 1 CH (12 нМ/мг белка/ч) и в мембранном препарате(3,1 í M/ìã белка/ч). Обогащение этого фермента составляет 3,1:12,0 = 0,26. Рассчитывают коэффициент Кф = 15:0,26 = 58. Полученное значение показывает, что такой препарат плазматических мембран может быть использован в любых биохимических исследованиях.

Пример 2, Удельная активность 5 нуклеотидазы в 1 СН и проверяемом препарате мембран составляет 75,4 и 997 нг Р/мг белка/ч соответственно. Обогащение этого фермента 997;75,4 - 13,2, Удельная активность фумарат-гидратэзы в 1 СН составила

12,0, а в мембранном препарате — 7,8 нМ/мг белка/ч. Обогащение фермента 7,8:12,0=0,65. Рассчитывают коэффициент К ь - 13,2

: 0,06-22,0. Такой препарат нельзя считать фракцией плаэматических мемб рн и использовать в биохимических иссле ованиПример 3, Удельная активность 5 нуклеотидазы в 1 СН и мембранном препарате составляет 85,7 и 1564 нг Рlмг белка/ч соответственно. Обогащение фермента

1564:85,4 = 18,2. Удельная активность фумарат-гидратаэы в этих препаратах 17,5 и

8,5. нМ/мг белка/ч. Обогащение фермента

8,5:17,5 - 0,49. Рассчитывают коэффициент

Кф = 18,2;0,49 = 37. Такие препараты можно использовать для определения функционального состояния плазматических мембран, но не для измерения их количественного состава.

Характерные соотношения активностей маркерных ферментов, получаемых при выделениях плаэматических мембран клеток, приведены в таблице.

Формула изобретения

1. Способ определения чистоты препаратов плазматических мембран клеток тканей лабораторных животных при отсутствии выраженной генетической патологии, включающий измерение активностей 5 -нуклеотидазы и маркерного фермента, характеризующего прочие компоненты клетки, и сравнение результатов измерений, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве маркерного фермента, характеризующего прочие компоненты клетки, используют фумарат-гидратазу.

2, Способ по п.1, отличающийся тем, что чистоту препаратов плаэматических мембран определяют по формуле Кф=-Н/Ф, где Н вЂ” обогащение 5-нуклеотидазы по отношению к исходному препарату; Ф— обогащение фумарат-гидратазы по отношению к исходному препарату, и при величине

Кф; равной и более 35 — 40, судят о достаточной чистоте препарата плвзматических мембран, 1709219

Составитель А. Семенов

Редактор Ю. Середа Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор T. Палий

Заказ,421 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и откратиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская нвб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101