Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. -продуцент моноклональных антител к инсулину человека

 

Изобретение относится к биотеХйог» логии и касается получения моноКлог :нальных антител к инсулину человека спомощью нового штамма гибридом. Цель изобретения " получение штамма гибридомы - продуцента моноклональных анти~ тел с более высоким средством к инсулину. Ытамм Е6Е5 получают гибридизацией иммунных клеток лимфоузлов мы;1Ш BALB/C с клетками миеломы РЗ-ХбЗ- . Ag8.653. Штамм Е6Е5 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР "ОД номером ВСКК(П) Д39Д. Клетки штамма Е6Е5 растут на среде RPMI 1640 или DMEM с 10% амбриональной телячьей сыворотки. Концентрация антител, продуцируемых штаммом ЕбЕ5, составляет в культуральной жидкости 30 мкг/мл, в асцитной жидкости 12 мг/мл. Аффинность антител составляет 7,5*10'' л/моль.г 1(л

9U„„1710576 (gl)g С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н автонсмОмм свидатеьствм

2 помощью нового штамма гибридом. Цель изобретения « получение штамма гибридомы - продуцента моноклональных антител с более высоким средством к инсулину. Штамм Е6Е5 получают гибридизацией иммунных клеток лимфоузлов мгпи

BALB/с с клетками миеломы РЗ-Х63-.

Ag8.653. Штамм Е6Е5 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии ЛН СССР под номером

ВСКК(П) 439Д. Клетки штамма Е6Е5 растут на среде RPMI 1640 или DMEM с 10% амбриональной телячьей сыворотки. Концентрация антител, продуцируемых штаммом Е6Е5, составляет в культуральной жидкости 30 мкг/мл, в асцитной жидкости 12 мг/мл. Лфинность антител . составляет 7,5 10 л/моль.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

tl0 ИЗОБРЕТЕНИЯИ И ОТКРЫТИЯ И

flPH ГКНТ СССР

1 (21) 4810181/13 (22) 03. 04. 90 (46) 07.02.92. Бюп, 1Ф 5

{71) Всесоюзный научно-исследователь= ский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) И.В. Ионов -и В.Л. Брин (53) 578.085.23(088.8) (56) Comitti et al. J. Immunol. 11е" (thods. V. 99/1/, р. 25,. 1987. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ.

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L.-ПРОДУ

ЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ЛНТИТЕЛ К ИНСУЛИНУ

ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехно логии и касается получения монокло.нальных антител к инсулину человека с

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения. моноклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом.

Цель изобретения - получение штамм" ма гибридных культивируемых клеток мйши Мцз пывси1из„ позволяющего получать моноклональные антитела с более высоким сродством к инсулину человека.

Новым штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus E6E5 продуцирует моноклональные антитела

Е6Е5 к инсулину человека с константой связывания 7,5 «10 л/моль. Кон-.".. центрация антител, продуцируемых штаммом Mus musculus E6E5, составляет

30 мкг/мл в культуральной жидкости и 12 мг/мл. в асцитной жидкости.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/ñ иммунизируют инсулином человека s полном адьюванте Фройнда в подушечки задних, лапок ! ,(по 50 мкг на мышь). Чистота инсулина проверена электрофоретически и. составляет 98%. На 13-й день мышей иммунизируют в подушечки задних лапок тем же количеством .инсулина в неполном адьюванте Фройнда. На 16-й день мышей забивают, достают подколенные лимфоузлы р и клетки лимфоузлов сливают с клетками .рииеломы РЗ.Х63. Ag 8.653 с помощью по лиэтиленгликоля ПЭГ 2000 (Merck). Со» отношение клеток лимфоузлов и клеток миеломы составляет 5: 1. После слияния клетки рассеваит в лунки 96 ячеечного планшета Nund в количестве 100 тыс.

171057 клеток на лунку, в которые предварительно высевают перитонеальные макрофаги мыши по 5000 клеток на лунку. Се" лекцию гибридом ведут в среде ГАТ

/RPNI 1640/ содержащей гипоксантин,. аминоптернн и тимидин/. Отбор растущих культур клеток, секретирующих ан». титела нужной специфичности проводят с помощью радиоиммунологического ана- 1ð

1 лиза: в лунки полихлорвинилового .планшета, покрытые антителами против иммуноглобулинов мыши, вносят культу» ральные жидкости растущих культур клеток, инкубируют 2 ч при комнатной температуре,:лунки промывают::и инкубируют с 125 меченьик инсулином. Лунки нарезают и просчитывают в гамма счетчике. Гибридому, секретирующую антитела к инсулину, дважды клонируют методом лимитирующих разведений, т.е. клетки рассеивают в лунках 96-ячеечных планшетов из расчета 1 клетка на . лунку в ростовой среде (Rem 1640 с !

10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 4 мМ L-. ãëþòàìèíà, 1Х пирувата.натрня, 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина). Выросшие. клоны тестируют на секрецию антител. Доля клонов, .сохраняющих продукцию антител задан- 30 пой специфичности, составляет f 00%..

Штамм обозначают Mus musculus, Штамм, 36Е5 хранится в Специализированной .коллекции перевиваемых соматических ! ) клеток позвоночных Института цитоло:гии АН СССР под.номером .ВСКК (П) 439 Д, и характеризуется следующими призна.ками.

Культуральные свойства.

Среда для культивирования RPMJ 40

1640 .или . ЖМЕМ.с 10%..эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 1Х пирувата натрия, 50 ЕД/мл пеницил-. лина и 25 мкг/мл стрептомицнна. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере, со- 45 о держащей 5Х СО . Для выращивания штаммов можно использовать стеклянную и. пластиковую культуральную посуду. Ха« актер роста — стационарная суспензия. астота пассирования-23 сут.Кратность. 50 ассева 1:3-1:4. При введении мышам

ALB/ñ, предварительно обработанных . истаном, по 1 млн. клеток, асцит обазуется через 10-15 дней. Стабильная продукция наблюдается в течение 7 пас55 . l сажей на мышах. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:256, s асцитической - 1:500000.

Продуктивность, Концентрация антител, продуцируемых штаммом E6ES, составляет в куль- туральной жидкости 30 мкг/мп, в асцитной жидкости 12 мг/мл. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре и 7 пассажей на животных, если гибридома перевивается.

Контаминация. . Бактерии и грибМ. в культурах не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окра» шивании красителями на ДИК и тимидиновом промечиванин культуральной среды. Консервация клеток.

Клетки штаммов замораживают после

2 и 3 клонирования на 10 .и 15 пассажах в культуре и после роста в внде.асцитной опухоли в мышах. Криозащитная среда 5ОХ ростовой среды, 40% эмбриональной телячьей сыворотки и 10Х диметилсульфокеида.

Режим замораживания: клетки в кри- озащитной среде помещают на сутки в холодильник при -70О, после чего переносят в жидкий азот. Выживаемость клеток после размораживания составляет

50Х.

Полезный продукт.

Моноклональные антитела IgG1 клас» са. Специфичность « инсулин человека, проинсулин человека. Метод оценки сохранения специфичности: кроличьи и антитела против,иммуноглобулинов мыши сорбируют на -поверхности лунок гибко»

ro планшета, в лунки вносят супернатанты клеток Е6Е5 затем планшет отмывают. и в лунки вносят 125 инсулин, планшет вновь отмывают, лунки выреза- . ют и просчитывают. в гамма-счетчике.

Аффинность антител составляет

7,5 х 10 л/моль.

Использование штамма Е6Е5 для получения антител к инсулину.

Пример 1. Получение антител

ЕбЕ5 с помощью штамма гибридом Е6Е5.

Для получения ионоклональных анти-. тел Е6Е5 клетки штамма гибридом Е6Е5 выращивают в пластиковых флаконах на среде для культивирования: RPMI 1640 (или DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ Ь-глютамнна>

1Х пирувата натрия, 50 ЕД/мп пенйциллина. и 25 мкг/мл стрептойипина, Концентрация клеток в среде не должна превышать 05 млн./ил. Когда число клеСоставитель Р. Наныкин

Техред- А,Кравчук Корректор M. Самборская

Редактор С. Патрушева

Заказ 311, Тираж Подписное

ВНИИНИ Государственного комитета но изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, М-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãoðoä, ул. Гагарина, 101

5, 1710576 6 ток достигнет 20 мпн., клетки вводят ным НоВТороМ в лу рюшинно в мышей которым за того инсул 10-14 дней ввели по О 5 мп пристана. (БСА) и инкубируют 2 ч при комнатной, ° °

j ° ля этого перед введением клеток в ьп - температуре. После инкубации содержи. ей культуральную жидкость, содержа- мое лунок удаляют, НН промывают

5 щую клетки штамма, центрифугируют . в каждую вносят по 50 мкл раствора

10 мин при 2000g, надосадочную куль- конъюгата кроличьих антител c nep«c турапьную жщдкость удаляют и клетки . даэой хрена к иммуноглобулинам мыши,,r штамма переводят в среду без 10Х 10 предварительно разведенного буферным эмбриональной телячьей сыворотки и . раствором в 1000 рез. Планшеты инкувкалывают внутрибрюшинно по 1 мин» . бируют еще 2 ч, отмывают и в лунки клеток на мышь. Через 10-14 дней, - вносят по.100 мкл субстратного буфер когда у.мышей вырастет асцит, мышей ного раствора,. содержащего о-фенилен-, забивают и c IIoMollgllo шприца забирают 15 дйамйн (0,4 мг/мп)и 0,0003Х-н лб .пере . асцитную жидкость . Асцитную жидкосТь кись водорода. Планшеты инкубируют . . цейтрифугируют при. 2000g в.-течение, 15-20 мин и в лунки вносят по 50 Мкл . 10 мин, чтобй освободиться от клеток, 2,5 И серной кислоты для остановки и надосадочную жидкость используют реакции. Планшеты сканируют на ридере для выделения монокпональных. антитеп. 20 для микропланшетов,при. длине волны

Х асцитной жидкости мыши, содержа- 492 нм. Концентрацию антител в анали-.

: щей моноклональные антитела Е685, до» эируемых образцах определяют по калиб- бавляют равный .объем насыщенного.. . . ровочной кривой, которую получают сульфата аммония и центрифугируют :: одновременно с проведением теста. Для при 5000g 10 мин.. Осадок растворяют, Б построения калибровочной кривой процетщательно диализуют против 0,05 И фос-., дуру проводят так же, но вместо анафатного буфера РН 7,2 и наносят на" . лизируемых образцов в лунки вносят колонку с ЭЕАЕ-52 целлюлозой, .ураййо- : разведения стандартных препаратов вешенную этим же буфером, Моноклональ- очищенных антител Е6Е5 в известной

we антитела выходят, не задерживаясь щ0 концентрации. Концентрация антител на.колонке. Иэ одного мл асцитной жид- Е6Е5 в купьтуральной жидкости штамма кости получается 10,5 мг моноклонапь-. . Е6Е5 равна 30 мкг/мл, в асцитной жид» ных антител Е6Е5. : " : кости 12 мг/мл. Измеряют .константу

Концентрацию антител в асцитной . : связывания антител Е6Е5, сорбированных и культуральной жидкостях штамма,"Е6Е5 на твердую фазу. определяют с помощью иммуноферментно"" Таким образом, предлагаемый штамм го анализа. 1.00 мкл раствора инсули- позволяет получать моноклональные ан на. в концентрации 10 мкг/мл в 0,2 M титела к.инсулину человека с констанборатном.буфере вносят влунки 96лу той связывания, в 3 раза превышающей ночного планшета для иммуноферментного о константу связывания антител, продуанализа и инкубируют 2 ч при комйат-. " . цируемых известным штаммом. ной температуре.По окончании инкуба.ции лунки промывают 3 раза водопра- .. Ф. о р м у л а и э о б р е т е н и я водной водой. Готовят .серию пятикрат ных разведений исследуемых проб в 45 Штамм гибридных культивируемых кле0,2 И буферном растворе РН 8,0.содер- -ток животных Mus musculus Ь. ВСКК (П) жащем 0,1Х желатины. Анализируемые .. 439 Д - продуцент моноклональных антиt пробы в объеме 50 мкл вносят с 2-:крат- тел к инсулину человека.